Entzündungsreize induzieren die Ausscheidung von Heparansulfat aus arteriellen, aber nicht aus venösen Schweineendothelzellen, was zu unterschiedlichen proinflammatorischen und prokoagulierenden Reaktionen führt

Aug 25, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4483 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine endotheliale Dysfunktion ist ein frühes Ereignis einer Gefäßschädigung, die durch einen proinflammatorischen und prokoagulierenden Endothelzellen-Phänotyp (EC) definiert ist. Obwohl eine Störung der endothelialen Glykokalyx mit Gefäßschäden verbunden ist, ist unbekannt, wie sich verschiedene Entzündungsreize auf die Glykokalyx auswirken und ob arterielle und venöse Zellen unterschiedlich reagieren. Mithilfe eines 3D-Rundkanal-Mikrofluidiksystems untersuchten wir die endotheliale Glykokalyx, insbesondere Heparansulfat (HS), an arteriellen und venösen ECs von Schweinen. Die Heparansulfat (HS)/Glykokalyx-Expression wurde bereits unter statischen Bedingungen auf venösen ECs beobachtet, während sie auf arteriellen Zellen flussabhängig war. Darüber hinaus ergab die Analyse der HS/Glykokalyx-Reaktion nach Stimulation mit Entzündungsreizen, dass venöse, aber nicht arterielle ECs gegen die HS-Ausscheidung resistent sind. Dieser Befund wurde auch an isolierten Schweinegefäßen beobachtet. Die Persistenz von HS auf venösen ECs verhinderte die Komplementablagerung und die Gerinnselbildung nach Stimulation mit Tumornekrosefaktor α oder Lipopolysaccharid, wohingegen nach xenogener Aktivierung kein Glykokalyx-vermittelter Schutz beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu reichte die HS-Abgabe auf arteriellen Zellen auch ohne eine entzündliche Schädigung aus, um einen proinflammatorischen und prokoagulierenden Phänotyp zu induzieren. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die dimorphe Reaktion arterieller und venöser ECs teilweise auf eine unterschiedliche HS/Glykokalyx-Dynamik zurückzuführen ist, was darauf hindeutet, dass arterielle und venöse thromboinflammatorische Erkrankungen gezielte Therapien erfordern.

Endothelzellen (ECs) bilden die Innenauskleidung von Blutgefäßen und sind entscheidend für die Regulierung der Gefäßhomöostase sowie für die Aufrechterhaltung eines entzündungshemmenden und gerinnungshemmenden Gefäßphänotyps1. Bei Gefäßerkrankungen ist diese Homöostase aufgrund einer endothelialen Dysfunktion2,3 gestört, was zu einem Verlust der Gefäßintegrität und einer erhöhten Permeabilität4, einer verringerten Freisetzung vasoaktiver Wirkstoffe wie Stickoxid (NO)5 sowie Veränderungen der Thrombogenität6 und der Oberflächenexpression führt Adhäsionsmoleküle, die die Leukozyteninteraktionen beeinflussen7,8. Eine endotheliale Dysfunktion ist stark mit der Ablösung der endothelialen Glykokalyx verbunden, einer Schutzschicht aus Proteinen und Zuckern, die die luminale Oberfläche von ECs bedeckt9. Die Hauptbestandteile der endothelialen Glykokalyx sind Proteoglykane wie Syndecane, die reich an Glykosaminoglykan-Seitenketten sind, wie etwa Heparansulfat (HS)10. Viele regulatorische Plasmaproteine, wie Antithrombin III (ATIII), C1-Inhibitor oder Faktor H, verfügen über HS-Bindungsdomänen11,12,13, über die sie mit der Glykokalyx interagieren. Die Bindung des komplementregulatorischen Proteins Faktor H an Zelloberflächen über Glykosaminoglykane ist entscheidend für den Schutz vor übermäßiger Komplementaktivierung14. Andererseits erhöht die Bindung von ATIII an die endotheliale Glykokalyx seine Hemmwirkung gegenüber dem Gerinnungsprotein Faktor XIa und blockiert dadurch die Aktivierung der Gerinnungskaskade15. Darüber hinaus wurde vermutet, dass die Glykokalyx einen nicht anhaftenden Schutzschild auf der Oberfläche von ECs bildet, der eine übermäßige Leukozytenadhäsion hemmt und dadurch die Leukozytentransmigration und Gewebeentzündung reduziert16. Daher spielt die endotheliale Glykokalyx, insbesondere HS, eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Gefäßhomöostase, indem sie ein entzündungshemmendes und gerinnungshemmendes Milieu aufrechterhält. Der Verlust der endothelialen Glykokalyx wurde bei vielen Erkrankungen beschrieben17. Beispielsweise steht eine endotheliale Dysfunktion zusammen mit kardiovaskulären Risikofaktoren wie Bluthochdruck, Diabetes und Fettleibigkeit in direktem Zusammenhang mit dem Verlust der endothelialen Glykokalyx von der Zelloberfläche, erhöhten thrombotischen Ereignissen und dem Fortschreiten der Krankheit18.

Die Glykokalyxablösung kommt auch während der Transplantation vor, wo sie mit einem schlechten Transplantatüberleben und einer Gewebeabstoßung einhergeht19. Dies ist teilweise auf hohe Konzentrationen des proinflammatorischen Zytokins TNFα20,21 zurückzuführen, das proteolytische Enzyme wie Heparanase und Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP9) hochreguliert, die Proteoglykane und HS von der Zelloberfläche abspalten, was zu einer gestörten Gefäßintegrität und Gefäßabstoßung führt22,23. Aufgrund des Mangels an menschlichen Organspendern konzentriert sich die Forschung in letzter Zeit auf die Xenotransplantation, die Transplantation von Geweben oder Organen zwischen zwei verschiedenen Arten. Schweine gelten derzeit als der vielversprechendste Organspender. Bei der Xenotransplantation induzieren vorgeformte Empfängerantikörper, die auf Zuckerreste auf der Oberfläche von Spender-ECs von Schweinen abzielen, die Glykokalyxablösung, Komplementablagerung und endotheliale Dysfunktion, was letztendlich in einer Organabstoßung gipfelt24,25,26.

Abgesehen von der Xenotransplantation ist die Sepsis ein weiterer entzündlicher Zustand, bei dem die Freisetzung endothelialer Glykokalyx als Krankheitszeichen gilt. Dort korreliert die Menge an Glykokalyx-Bestandteilen, die von ECs abgegeben und im Plasma gemessen werden, mit der Entwicklung einer disseminierten intravaskulären Koagulation27 und einer verringerten Überlebensrate der Patienten28.

Obwohl gezeigt wurde, dass entzündliche Zustände die Glykokalyx schädigen und Krankheiten auslösen oder verbreiten, ist unbekannt, ob die Glykokalyx auf ECs aus verschiedenen Gefäßbetten unterschiedlich auf entzündliche Angriffe reagiert und ob dies einen Einfluss auf das EC-Verhalten hat. Pathophysiologische Unterschiede im hyperkoagulierbaren Zustand arterieller und venöser Zellen wurden beschrieben29. ECs der unteren Hohlvene regulieren im Vergleich zu Aorten-ECs die Expression von Adhäsionsmolekülen als Reaktion auf das proinflammatorische Zytokin TNFα30 stark hoch. Ob diese Heterogenität zwischen ECs auf Unterschiede im Glykokalyxmuster auf der Zelloberfläche zurückzuführen ist und ob dies zu einer stärkeren endothelialen Dysfunktion in Venen im Vergleich zur Aorta führt, ist noch unbekannt. Wir nehmen an, dass Unterschiede in der Dynamik der Glykokalyx die Interaktion des Endothels mit regulatorischen Proteinen beeinflussen, was zu unterschiedlichen Reaktionen in verschiedenen Gefäßbetten führt.

Um festzustellen, ob die Dynamik der Glykokalyx für arterielle und venöse Zellen unterschiedlich ist, vergleichen wir das Expressionsmuster der Glykokalyx auf primären arteriellen und venösen ECs von Schweinen mithilfe eines 3D-Mikrofluidiksystems mit rundem Kanal. Wir konzentrieren uns auf die Analyse der Rolle von HS, dem Hauptakteur bei der Aufrechterhaltung der physiologischen Glykokalyxfunktionen11, unter statischen oder Strömungsbedingungen und auf die Stimulation mit verschiedenen Entzündungsreizen wie menschlichem Serum, um eine Xenotransplantationsumgebung, TNFα und LPS nachzuahmen. Das Zusammenspiel zwischen Glykokalyx und endothelialer Dysfunktion wurde durch die Auswertung der Komplementaktivierung, der Leukozytenadhäsion und der Aktivierung der Gerinnungskaskade analysiert.

Primäre makrovaskuläre ECs wurden aus der Brustaorta und Hohlvene von Schweinen isoliert, die von weiblichen und männlichen Landrassenschweinen im Alter von 4–8 Monaten nach der Euthanasie gewonnen wurden. Gemäß den 3R-Prinzipien wurden die Gefäße von Tieren gewonnen, die für Endexperimente anderer Forschungsgruppen der Universität Bern verwendet wurden. Für diese Tiere wurde eine Vollnarkose mit Propofol (1–4 mg/kg) und Ketamin (1 mg/kg) bereitgestellt, die mit Propofol (2–8 mg/kg/h) und Fentanyl (5–30 g/kg/h) aufrechterhalten wurde ) und zusätzliche Analgesie wurde mit Ropivacain (0,5 %) und Morphin (0,1 mg/kg) bereitgestellt. Als Tod des Tieres wurde entweder die Entfernung des Herzens aus dem Körper definiert oder wenn das EEG-Signal nach der Verabreichung von Rocuronium und dem Absetzen der mechanischen Beatmung mindestens 60 Sekunden lang flach blieb. Tierversuche und Euthanasie wurden in Übereinstimmung mit den schweizerischen Bundesvorschriften durchgeführt und vom kantonalen Veterinäramt Bern, Schweiz, genehmigt. Arterielle ECs wurden mechanisch aus dem Lumen der Aorta mit einem angefeuchteten Wattestäbchen entnommen, während venöse ECs aus der Hohlvene durch enzymatische Verdauung mit Kollagenase II (Worthington LS004174, 1,88 U/ml in reinem DMEM) entnommen wurden. Die Zellen wurden in Komplettmedium (DMEM Glutamax, Gibco 21885-025) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS, Sigma F7542) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S, Gibco 15140-122), ergänzt mit 1 % Endothel, gezüchtet Wachstumsmedium-2-Ergänzungsmischung (PromoCell C-39216) verabreicht und täglich überwacht, um ein übermäßiges Wachstum von Fibroblasten zu vermeiden. Nach der Konfluenz wurden die Zellen phänotypisiert, kryokonserviert und für zukünftige Experimente gelagert. Die Zellen wurden durch Anfärben auf die EC-Marker CD31 und von Willebrand-Faktor sowie auf α-Aktin der glatten Muskulatur phänotypisiert, um die Reinheit zu überprüfen. Es wurden nur Kulturen verwendet, die beide EC-Marker und weniger als 10 % α-Aktin der glatten Muskulatur exprimierten. Die Zellen wurden ausschließlich bis zur vierten Passage verwendet, um eine phänotypische Drift zu vermeiden. Für alle Experimente wurden ECs von mindestens 2 verschiedenen Schweinespendern verwendet.

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden durch Dichtezentrifugation frisch aus menschlichem oder Schweine-EDTA-antikoaguliertem Vollblut isoliert. Menschliche Blutproben wurden von gesunden Freiwilligen mit Einverständniserklärung entnommen und unmittelbar nach der Spende anonymisiert. Das Studienprotokoll wurde von der örtlichen Ethikkommission des Kantons Bern genehmigt und die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den eidgenössischen Vorschriften und Richtlinien der Universität Bern durchgeführt. Zur PBMC-Isolierung wurde das Blut zunächst zentrifugiert, um das Plasma zu entfernen, das dann durch gleiche Mengen PBS-2 % FBS ersetzt wurde. Das verdünnte Blut wurde auf Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugationsmedium (Cytivia 17144002) geschichtet und PBMCs wurden gemäß dem Herstellerprotokoll isoliert. Anschließend wurden PBMCs mit PBS-2 % FBS gewaschen. Menschliche PBMCs wurden nach der Isolierung frisch verwendet, während Schweine-PBMCs zur späteren Verwendung in FBS mit 10 % DMSO (Dimethylsulfoxid, Sigma D4540-100ML) eingefroren wurden.

Mikrofluidikchips aus Polydimethylsiloxan (PDMS), die 3D-Kanäle mit rundem Querschnitt und einem Durchmesser von 550 μm enthalten, wurden wie zuvor beschrieben hergestellt31. Die mikrofluidischen Kanäle wurden mit 50 μg/ml Fibronektin (Merck FC010) und 100 μg/ml Kollagen II (Gibco A10644-01) beschichtet. Arterielle und venöse ECs wurden dann in Flussmedium (DMEM mit 10 % FBS, 1 % P/S, 4 % Dextran, Sigma 31390-100G und 1 % Rinderserumalbumin, Sigma A7030-100G) ausgesät (1 Million Zellen/ml). und über Nacht bei 37 °C haften lassen. Nach der Konfluenz wurde jeder Kanal mit einer peristaltischen Pumpe (Gilson Minipuls 3) verbunden. Mithilfe von Silikonschläuchen wurden die Fließmedien aus einem Reservoir entnommen und durch eine Blasenfalle geleitet, bevor sie die Zellen erreichten. Die peristaltische Pumpe wurde so eingestellt, dass sie 72 Stunden lang eine laminare Scherspannung von 2 dyn/cm2 oder 12 dyn/cm2 (Viskosität des Mediums μ = 2,1 mPa s) erzeugte. Mikrofluidische Chips wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 aufbewahrt. Das Medium wurde alle 24 Stunden gewechselt, um frische Nährstoffe bereitzustellen.

Für mikrofluidische Kanäle wurden die Zellen 72 Stunden lang unter Durchfluss oder unter statischen Bedingungen kultiviert und anschließend mit 4 % Formaldehyd (Sigma 252549-500ML Stammlösung 37 %) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Nach einstündigem Blockieren bei Raumtemperatur mit PBS-3 % BSA wurden die Zellen über Nacht bei 4 °C mit Anti-Heparansulfat-Antikörper (Amsbio 370-255-1, Klon F58-10E4), Weizenkeim-Agglutinin (WGA)-Lectin, inkubiert (Sigma L4895-2MG) zum Färben von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und Sialinsäure, Anti-Schweine-CD31-Antikörper (R&D MAB33871) und/oder polyklonaler Anti-Human-Komplementkomponente C3b/c (DAKO A0062), verdünnt in PBS-1 % BSA -0,05 % Tween (Tween 20, AppliChem A4974,0250). Anschließend wurden die Proben 1,5 Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur mit sekundären Antikörpern inkubiert: Ziegen-Anti-Maus-IgM AlexaFluor568 (Invitrogen A21043) oder Ziegen-Anti-Maus-IgM AlexaFluor488 (Invitrogen A21042) für Heparansulfat, Ziegen-Anti-Ratten-IgG AlexaFluor633 (Invitrogen A21094) oder Ziegen-Anti-Ratten-IgG AlexaFluor568 (Invitrogen A11077) für CD31 und/oder Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG AlexaFluor633 (Invitrogen A21071) für C3b/c. Alle sekundären Antikörper wurden in PBS-1 % BSA-0,05 % Tween verdünnt. DAPI (Simga, 32670-20MG-F) wurde zur Färbung von Zellkernen verwendet. Mikrofluidische Chips wurden dann gewaschen und mit einem 20-fach-Objektiv auf einem Zeiss LSM710 AxioObserver oder Zeiss LSM980 konfokalen Mikroskop abgebildet und mit Image J (Version 2.3.0/1.53q) analysiert. Die GlcNAc/Sialinsäure- und HS-Färbung wurde durch Quantifizierung der Abdeckung gemäß einer von Cheng et al.32 übernommenen Methode analysiert. Zur Quantifizierung wurde der Fluoreszenzschwellenwert angepasst, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren, und das Bild wurde in eine Schwarz-Weiß-Maske umgewandelt. ImageJ wurde verwendet, um den Prozentsatz der weißen Bereiche im Vergleich zur Kanalfläche zu messen, und dieser Prozentsatz wurde der Glykokalyxabdeckung gleichgesetzt, die auf die Anzahl der Zellen pro Kanal normalisiert wurde. Pro Probe wurden mindestens drei Bilder analysiert. Für Kammerobjektträger, die zur Charakterisierung kultivierter ECs verwendet werden, wurde das gleiche Verfahren wie oben beschrieben angewendet. Anschließend wurden die Objektträger mit ProLong-Gold-Antifade-Reagenz (Invitrogen P36934) montiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung (Leica DMI4000B) aufgenommen.

En-face-Gefäße wurden aus frisch isolierter Brustaorta und Vena cava von Schweinen hergestellt, in 1 cm² große Stücke geschnitten und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Formaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Gefäßstücke blockiert und wie oben beschrieben auf von-Willebrand-Faktor (DAKO A0082), CD31 und Glykokalyxkomponenten gefärbt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop (Zeiss AxioObserver LSM710) aufgenommen.

Um Gefäßabschnitte zu erhalten, wurden Ringe frisch isolierter Brustaorta und Vena cava von Schweinen in TissueTek OCT-Compound (Sakura 4583) eingebettet. 5 μm dicke Schnitte wurden mit kaltem 100 % Aceton (AppliChem 141007.1211) fixiert und 30 Minuten lang mit 20 % NHS, verdünnt in TBS, inkubiert, um die HS-Abspaltung und Komplementablagerung zu induzieren. Kontrollabschnitte wurden nur mit TBS inkubiert. Kryoschnitte wurden mit TBS-3 % BSA blockiert, gefärbt und wie oben beschrieben montiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung (Zeiss LSM980) aufgenommen. Um die Glykokalyx auf lebenden, nicht fixierten Zellen abzubilden, wurden mikrofluidische Kanäle 72 Stunden lang perfundiert (2 dyn/cm2 oder 12 dyn/cm2) und dann 30 Minuten lang unter Durchfluss mit WGA-Lectin und Hoechst-Kernfärbung unter Verwendung der oben beschriebenen Verdünnungen im Durchfluss gefärbt Medien ohne FBS. Die Kanäle wurden sofort mit einem konfokalen Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung (Zeiss LSM980) abgebildet.

Nach 72 Stunden hoher Scherbeanspruchung (12 dyn/cm2) wurden die Zellen unbehandelt gelassen oder unter Durchfluss entweder mit 10 % normalem Humanserum (gesammelt von gesunden Freiwilligen) für 2 Stunden oder 100 ng/ml rekombinantem humanem Tumornekrosefaktor α (TNFα) inkubiert , R&D 210-TA), 100 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS, Sigma L4391) oder 5 U/ml Heparinase I + III (Sigma H3917-100UN) für 4 Stunden bei 37 °C in serumfreien Fließmedien. Um die Komplementablagerung auf mit TNFα, LPS und Heparinase I + III stimulierten Zellen zu bewerten, wurden die Kanäle während der letzten 2 Stunden der Aktivierung zusätzlich mit 10 % Schweineserum perfundiert. Nach der Fixierung wurden die Proben wie oben beschrieben mit einem Anti-Komplement-C3b/c-Antikörper gefärbt.

Die Zellen wurden in mikrofluidischen 3D-Rundschnittkanälen ausgesät und 72 Stunden lang unter Scherstressbedingungen von 12 dyn/cm2 perfundiert. Anschließend wurden sie wie oben beschrieben mit normalem menschlichem Serum, rekombinantem menschlichem TNFα, LPS oder Heparinase I + III behandelt. Kerne von ECs innerhalb der Kanäle wurden unter Strömung mit Hoechst 3342-Kernfärbung (Tocris 23491-52-3) gefärbt. Als nächstes wurden von Menschen oder Schweinen isolierte PBMCs gemäß den Anweisungen des Herstellers mit CFSE (ThermoFisher C34554) markiert und in Fließmedien ohne Dextran resuspendiert. Jeder Kanal wurde bei einer Scherspannung von 0,2 dyn/cm2 mit 1 Million/ml markierten PBMCs perfundiert, während 20 Minuten lang alle 3 s Bilder aufgenommen wurden. Zur Analyse wurden Videodateien mit einer Bildrate von 3 Bildern pro Sekunde erstellt. Die PBMC-Adhäsion wurde als die Anzahl der Zellen definiert, die mindestens 3 s (dh ein Bild) immobilisiert waren. Die Zellen wurden für jede Zeitrafferaufnahme manuell gezählt. Die Kanäle wurden nach der PBMC-Perfusion fixiert und wie oben beschrieben auf HS gefärbt.

Die Zellen wurden wie oben beschrieben in runden 3D-Mikrofluidkanälen ausgesät und anschließend bei einer Scherspannung von 12 dyn/cm2 mit rekalzifiziertem Citratplasma von Mensch (von gesunden, anonymen Freiwilligen) oder Schwein (Merck P2891), versetzt mit 15 μg/ml markiertem AF488, perfundiert menschliches Fibrinogen (Thermofisher F13191). Mit Fibrinogen versetztes Plasma wurde durch Zugabe von 25 mM (menschliches Plasma) oder 13 mM (Schweineplasma) CaCl2 (Sigma 10043-52-4) unmittelbar vor der Bildgebung rekalzifiziert. Während der Perfusion wurden die Zellen alle 5 s bis zu 15 Minuten lang mit einem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM980) abgebildet. Das Experiment wurde beendet, wenn eine vollständige Okklusion des Kanals auftrat oder wenn die Okklusion des Kanals einen Druckanstieg im Mikrofluidiksystem verursachte, der zur vollständigen Zellablösung von der Kanaloberfläche führte. Die Zeit bis zur Okklusion wurde anhand von Videodateien mit einer Bildrate von 3 Bildern pro Sekunde bestimmt.

Alle Datensätze wurden mit der GraphPad Prism 9-Software analysiert und p < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Für Datensätze mit mehr als zwei Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von mehreren Vergleichen mithilfe des paarweisen Tukey-t-Tests durchgeführt. Für die Komplementablagerung wurde eine Zwei-Wege-ANOVA zur PBCM-Adhäsion und -Gerinnung durchgeführt, gefolgt von mehreren Vergleichen mittels Tukey- und Bonferroni-Post-hoc-Analyse. Die Experimente wurden mit mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt.

Um festzustellen, wie sich Scherspannung auf die Expression verschiedener Glykokalyx-Komponenten auswirkt und um zu untersuchen, ob die Glykokalyx für das unterschiedliche Verhalten arterieller und venöser ECs bei entzündlichen Erkrankungen verantwortlich sein könnte, haben wir die Abdeckung der Glykokalyx auf der EC-Oberfläche durch Immunfluoreszenz analysiert. Venöse und arterielle Zellen wurden 72 Stunden lang unter statischen oder laminaren Scherstressbedingungen (12 dyn/cm2 und 2 dyn/cm2) in einem 3D-Rundkanal-Mikrofluidsystem gezüchtet31. Diese Scherspannungsbedingungen wurden in Übereinstimmung mit den physiologischen Scherspannungswerten für Aorta und Hohlvene ausgewählt, die anhand von In-vivo-Daten ermittelt wurden 33. Die Zellen wurden mit Weizenkeim-Agglutinin (WGA)-Lektin gefärbt, das an N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und Sialinsäure bindet ( Sia)-Reste, die in der endothelialen Glykokalyx vorhanden sind. Die WGA-Färbung wird häufig zur spezifischen Markierung, Visualisierung und Quantifizierung der Glykokalyx auf Gefäßendothel eingesetzt34,35. Wie in Abb. 1A–D gezeigt, wurde die WGA-Färbung (GlcNAc, Sia) hauptsächlich bei laminarer Scherbelastung sowohl auf arteriellen als auch auf venösen ECs beobachtet. Andererseits war HS, die Hauptkomponente der Glykokalyx, die von ECs exprimiert wird und für die Aufrechterhaltung physiologischer entzündungshemmender und gerinnungshemmender Eigenschaften verantwortlich ist, von arteriellen Zellen abhängig vom Fluss (Abb. 1E, F), während HS überraschenderweise bereits unter statischen Bedingungen beobachtet wurde auf der Oberfläche venöser ECs (Abb. 1G, H). Dies weist darauf hin, dass die Dynamik der Glykokalyx zwischen arteriellen und venösen Zellen unterschiedlich ist. Darüber hinaus beeinflussten Änderungen der Scherspannung die HS-Verteilung. Unter Bedingungen geringer Scherung (2 dyn/cm2) befand sich HS entlang der Verbindungsbereiche von ECs, während sich HS bei Anwendung hoher Scherspannung in bestimmten Bereichen der Zellmembran ansammelte (Abb. 1E, G). Es wurde gezeigt, dass die Clusterbildung von Proteoglykanen, die HS enthalten, wie Syndecan-4, an bestimmten Membran-Lipid-Raft-Regionen auftritt und für den Vesikeltransport und die Signaltransduktion wichtig ist36.

Einfluss der Scherbeanspruchung auf die Bedeckung von arteriellen und venösen Endothelzellen mit Glykokalyx/N-Acetylglucosamin, Sialinsäure und Heparansulfat. Repräsentative Bilder von Mikrofluidikkanälen, die (A,E) arterielle oder (C,G) venöse Schweineendothelzellen enthalten, die unter statischen Bedingungen bei niedriger (2 dyn/cm2) oder hoher Scherspannung (12 dyn/cm2) kultiviert wurden. Die Zellen wurden (A,C) für N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und Sialinsäure (Sia) in Grün oder (E,G) für Heparansulfat (HS) in Rot gefärbt. Kerne sind blau dargestellt (DAPI). Alle Bilder wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM710-Mikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken: 50 μm. (B,D,F,H) Die Abdeckung der Glykokalyx-Komponenten (GlcNAc/Sia oder HS) wurde für jedes Bild (4 Bilder/Bedingung/Experiment) als Prozentsatz der Fläche berechnet, die positiv für (B,D) GlcNAc und Sia oder (F) ist ,H) für HS und wurde auf die Gesamtzahl der Zellen/Bild normalisiert. Die Daten stammen aus drei oder mehr unabhängigen Experimenten und 2–3 verschiedenen Schweine-EC-Spendern. Für die statistische Analyse wurde eine einfaktorielle ANOVA mit mehreren Vergleichen verwendet.

Um sicherzustellen, dass ECs in vitro einen ähnlichen Phänotyp wie ECs in vivo aufweisen, wurden frisch isolierte Brustaorta und Vena cava von Schweinen direkt mit EC-Markern wie CD31 und vWF (von Willebrand-Faktor) und für die Glykokalyx mit beiden WGA gefärbt Lektin und Anti-HS-Antikörper. Wie in der ergänzenden Abbildung S1 gezeigt, zeigen in vitro gezüchtete ECs einen ähnlichen Phänotyp wie ECs in vivo in Blutgefäßen.

Veränderungen in der Glykokalyx und die Freisetzung von HS führen zu einem Verlust der Proteinbindung und werden bei Verletzungen durch Ischämie und Reperfusion sowie bei Transplantationen beobachtet. Aufgrund des weltweiten Organmangels wird derzeit die Transplantation von Organen zwischen zwei verschiedenen Arten stark in Betracht gezogen37.

Um festzustellen, ob der Unterschied in der Glykokalyxdynamik zwischen arteriellen und venösen Zellen während eines entzündlichen Zustands wie einer Xenotransplantation unterschiedliche Reaktionen hervorrufen würde, wurden arterielle und venöse Schweine-ECs mit normalem menschlichem Serum (NHS) perfundiert, um in vitro eine Xenotransplantationsumgebung nachzuahmen. Es wurde gezeigt, dass die Bindung vorgebildeter xenoreaktiver Antikörper an Xenoantigene, die auf der EC-Oberfläche exprimiert werden, wie z. B. α-Galactose24, die Abspaltung der EC-Glykokalyx38 induziert, was zur Transplantatabstoßung führt. Wir beobachteten das Ablösen von HS von der Oberfläche arterieller ECs, die mit NHS stimuliert wurden (Abb. 2A, B; (-) und Serum). Dies korrelierte mit einer erhöhten Expression von E-Selectin (Ergänzende Abbildung S2A; (-) und Serum), einem wichtigen Adhäsionsmolekül, das teilweise für die Wechselwirkung von ECs mit Leukozyten verantwortlich ist. Überraschenderweise induzierte die Stimulation venöser ECs mit NHS keinen HS-Ausstoß; Eine HS-Bedeckung von 16–18 % wurde sowohl bei aktivierten als auch bei nicht aktivierten ECs beobachtet (Abb. 2C, D; (-) und Serum). Bei arteriellen ECs war die E-Selectin-Expression jedoch nach Inkubation mit NHS erhöht (ergänzende Abbildung S2B). Um sicherzustellen, dass HS tatsächlich von der Oberfläche venöser Zellen abgestoßen werden kann, wurden ECs mit Heparinase I + III perfundiert, einem Enzym, das HS spezifisch spaltet. Wie in Abb. 2A, C zu sehen ist, entfernt die Inkubation mit Heparinase etwa 50 % (Abb. 2B) bzw. 70 % (Abb. 2D) des HS aus arteriellen bzw. venösen Zellen. Andere Glykokalyxkomponenten wie GlcNAc und Sialinsäure wurden weder durch NHS (ergänzende Abbildung S3A, B) noch, wie erwartet, durch Heparinase-Behandlung (ergänzende Abbildung S3C) beeinträchtigt.

Der Widerstand gegen die Ausscheidung von Heparansulfat auf xenogen aktivierten Venenzellen verhindert nicht die Ablagerung von C3b/c. (A,C) Repräsentative Bilder von Heparansulfat (HS) auf der Zelloberfläche unbehandelter Zellen (−), perfundiert mit 10 % normalem Humanserum (Serum) oder 5 U/ml Heparinase (Heparinase). HS wird in Rot und Kerne in Blau dargestellt (DAPI). Maßstabsbalken: 50 μm (B, D) Die HS-Ablösung wurde für jedes Bild (4 Bilder/Bedingung/Experiment) als Prozentsatz der HS-positiven Fläche quantifiziert und auf die Gesamtzahl der Zellen/Bild normalisiert. (E,G) Repräsentative Bilder der Komplement-C3b/c-Ablagerung auf der Zelloberfläche von unbehandelten Zellen (−), perfundiert mit 10 % normalem Humanserum (Serum) oder 5 U/ml Heparinase (Heparinase). C3b/c ist in Gelb und Kerne in Blau dargestellt (DAPI). Maßstabsbalken: 50 μm (F,H) C3b/c-Ablagerung wurde als Prozentsatz der C3b/c-positiven Zellen/Gesamtzahl der Zellen/Bild (4 Bilder/Bedingung/Experiment) gemessen. Die Daten wurden mit Fiji-Software quantifiziert. Alle Bilder wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM980-Mikroskop aufgenommen. Die Daten stammen aus drei oder mehr unabhängigen Experimenten und 2–3 verschiedenen Schweine-EC-Spendern. Für die statistische Analyse wurde eine einfaktorielle ANOVA mit mehreren Vergleichen verwendet.

Um zu bestätigen, dass unsere Beobachtungen nicht nur auf kultivierte ECs beschränkt sind, wurden Kryoschnitte frisch isolierter Brustaorta und Vena cava von Schweinen ex vivo mit NHS behandelt und auf HS-Abdeckung analysiert. Auch hier wurde ein HS-Abgang aus der Arterie, jedoch nicht aus der Vene beobachtet (ergänzende Abbildung S4). Um darüber hinaus mögliche Artefakte bei der Glykokalyxbedeckung aufgrund der Fixierung auszuschließen, wurde eine GlcNAc/Sia-Färbung an lebenden, nicht fixierten Zellen durchgeführt. Wie in der ergänzenden Abbildung S5 gezeigt, ist die Abdeckung von GlcNAc/Sia sowohl bei lebenden als auch bei festen arteriellen und venösen ECs unter Bedingungen niedriger und hoher Scherspannung vergleichbar. Um außerdem sicherzustellen, dass die im Versuchsaufbau verwendete hohe Scherspannung die HS-Abgabe aus venösen ECs, die normalerweise eine Umgebung mit geringerer Scherung erfordern, nicht beeinträchtigt, wurde die NHS-Perfusion unter venösen Scherspannungsbedingungen (2 dyn/cm2) durchgeführt. . Auch hier wurde HS nur von der Oberfläche arterieller Zellen abgegeben (Ergänzende Abbildung S6A – D).

Die Ausscheidung von HS wurde mit einem proinflammatorischen EC-Phänotyp in Verbindung gebracht, der zu Komplementablagerungen, Leukozytenadhäsion und Koagulation neigt.

Die Komplementablagerung sowohl auf arteriellen als auch auf venösen Zellen wurde durch Immunfluoreszenz nach Perfusion von Zellen mit NHS bei einer Scherspannung von 12 dyn/cm2 bewertet. Die Wahl einer höheren Scherbeanspruchung basierte auf der Beobachtung, dass Scherung die Komplementrezeptorexpression auf ECs steigern und eine bessere Visualisierung der Komplementablagerung ermöglichen kann39. Alle drei Wege der aktivierten Komplementkaskade verschmelzen auf der Ebene von C3, einem wesentlichen Bestandteil des Komplementsystems, in dem die Signalverstärkung stattfindet40. Daher wurde die Ablagerung von C3b/c, dem Produkt der C3-Spaltung durch Komplement-C3-Konvertase-Enzyme, als Marker für die Komplementaktivierung verwendet. Obwohl die Ablösung der endothelialen Glykokalyx nur bei NHS-aktivierten Arterienzellen beobachtet wurde (Abb. 2A – D), wurde interessanterweise bei beiden Zelltypen eine Komplement-C3b/c-Ablagerung beobachtet (Abb. 2E – H), was darauf hinweist, dass HS bestehen bleibt venöse Zellen schützt nicht vor Komplementablagerung. Um festzustellen, ob die Entfernung von HS die Komplementablagerung steigern würde, wurden die Zellen mit Heparinase behandelt. Die Bindung von C3b/c an arterielle und venöse Zellen nahm im Vergleich zu NHS-stimulierten Zellen nicht zu (Abb. 2E–H), was bestätigt, dass HS auf venösen Zellen keine Rolle bei der Regulierung der Komplementablagerung in einem Xenotransplantationsaufbau spielt.

Um zu untersuchen, ob die Komplementablagerung auf der Zelloberfläche die Ausscheidung von HS fördert, wurden Kanäle mit hitzeinaktiviertem NHS (HI-Serum) perfundiert. Hitze blockiert die Aktivierung des Komplementsystems, daher ist nur eine minimale Ablagerung von C3b/c zu erwarten. Die Inkubation sowohl arterieller als auch venöser Zellen mit hitzeinaktiviertem NHS führte nicht zu einer Ausscheidung von HS (Ergänzungsabbildung S7A – D) und zu einer C3b/c-Ablagerung (Ergänzungsabbildung S7E – H). Dies zeigt, dass die HS-Ausscheidung aus arteriellen Zellen durch die Inaktivierung des Komplementsystems erheblich reduziert werden könnte, was darauf hindeutet, dass die Komplementablagerung auf arteriellen Zellen mit der HS-Ausscheidung korreliert.

Als nächstes untersuchten wir die Bindung menschlicher PBMCs an xenogen aktivierte Schweine-ECs. Die Adhäsion von PBMCs wurde als Anzahl der Leukozyten quantifiziert, die mindestens 3 s lang an die Zelloberfläche binden. Es wurde eine ähnliche Bindung von PBMC an arterielle und venöse Zellen festgestellt (Abb. 3A – C). Wie in der ergänzenden Abbildung S2 gezeigt, wird E-Selectin nach Perfusion mit NHS sowohl auf arteriellen als auch auf venösen Zellen exprimiert.

Die Persistenz von Heparansulfat auf venösen Zellen nach xenogener Aktivierung kann die Adhäsion von Leukozyten und die Bildung von Blutgerinnseln nicht verhindern. (A,B) Repräsentative Bilder von 3 Zeitrafferaufnahmen der Bindung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMCs; grün dargestellt) an (A) arterielle und (B) venöse Endothelzellen vom Schwein, die unbehandelt (-) oder mit beiden perfundiert wurden 10 % normales Humanserum (Serum) oder 5 U/ml Heparinase (Heparinase). Zellkerne sind blau dargestellt (Hoechst). Maßstabsbalken: 50 μm. (C) Anhaftende PBMCs wurden aus 20-minütigen Zeitrafferaufzeichnungen von vier unabhängigen Experimenten quantifiziert, indem Zellen gezählt wurden, die für ≧ 3 s immobilisiert waren. (D,E) Repräsentative Bilder von Fibringerinnseln (grün), die sich auf (D) arteriellen oder (E) venösen ECs von Schweinen bilden. Die Zellen wurden unbehandelt gelassen (-) oder entweder mit 10 % normalem Humanserum (Serum) oder 5 U/ml Heparinase (Heparinase) perfundiert, bevor rekalzifiziertes Citrat-Humanplasma, versetzt mit AlexaFluor488-markiertem Humanfibrinogen (grün), zugegeben wurde. Maßstabsbalken: 200 μm. (F) Die Zeit bis zum Verschluss wurde als vollständiger Kanalverschluss oder Zellablösung bestimmt und aus Zeitrafferaufzeichnungen von mit Plasma durchströmten Kanälen quantifiziert. Die Daten stammen aus vier unabhängigen Experimenten mit 2–3 verschiedenen Schweine-EC-Spendern und wurden mit Fiji-Software analysiert. Für die statistische Analyse wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit Tukey- und Bonferroni-Post-hoc-Test verwendet.

Um festzustellen, ob die HS-Abgabe in Abwesenheit eines Entzündungsreizes eine Leukozytenbindung verursacht, wurden ECs mit Heparinase behandelt. Heparinase aktiviert keine ECs, tatsächlich wurde auf der Zelloberfläche beider Zelltypen kein E-Selectin exprimiert (ergänzende Abbildung S2). Unerwarteterweise reichte die Ausscheidung von HS aus mit Heparinase behandelten arteriellen, aber nicht venösen Zellen aus, um die Adhäsion menschlicher PBMCs zu induzieren (Abb. 3C). Dies weist darauf hin, dass die E-Selectin-Expression für die Leukozytenbindung an venöse ECs wesentlich ist, während HS die PBMC-Adhäsion an arterielle ECs beeinflusst.

Anschließend analysierten wir den Einfluss der HS-Abgabe auf die Gerinnselbildung, indem wir sowohl arterielle als auch venöse Zellen mit rekalzifiziertem menschlichem Plasma, versetzt mit fluoreszierend markiertem menschlichem Fibrinogen, perfundierten. Wie in Abb. 3D–F gezeigt, wurde die Zeit bis zur Gerinnselbildung sowohl bei mit NHS aktivierten arteriellen als auch venösen ECs im Vergleich zu unbehandelten Zellen um etwa 50 % bzw. 40 % verkürzt (Abb. 3F), was darauf hindeutet, dass HS in den Venen intakt ist Zellen verhindert die Gerinnung nicht. Interessanterweise dauerte es bei unbehandelten arteriellen Zellen bis zur Gerinnselbildung 8 Minuten, während Kanäle, die venöse Zellen enthielten, bereits nach 5 Minuten verstopften (Abb. 3F). Dies weist darauf hin, dass zwischen diesen beiden Zelltypen ein grundlegender Unterschied in der Gerinnungszeit besteht.

Um die Rolle von HS bei der Gerinnung weiter zu untersuchen, wurden Zellen vor der Perfusion mit mit Fibrinogen versetztem menschlichem Plasma mit Heparinase behandelt. Wie in Abb. 3D–F gezeigt, wurde zwar die Zeit bis zum Verschluss von mit arteriellen ECs besiedelten Kanälen durch die HS-Abgabe verkürzt, es wurde jedoch keine Auswirkung auf venöse Zellen beobachtet. Dies legt nahe, dass die Entfernung von HS aus arteriellen Zellen ausreicht, um einen prokoagulierenden Phänotyp zu induzieren.

Um festzustellen, ob venöse Zellen auch unter verschiedenen proinflammatorischen Bedingungen gegen die HS-Abgabe resistent sind, haben wir ECs mit TNFα und LPS stimuliert und die HS-Abdeckung wie oben beschrieben gemessen. Bei TNFα- und LPS-aktivierten arteriellen ECs wurde ein HS-Ausstoß beobachtet (Abb. 4A, B), aber wiederum nicht bei aktivierten venösen ECs (Abb. 4C, D). Tatsächlich war HS auf der Zelloberfläche von TNFα- und LPS-behandelten arteriellen Zellen im Vergleich zur Kontrolle um 41 % bzw. 30 % reduziert (Abb. 4B), während es auf der Oberfläche venöser ECs unverändert blieb (Abb. 4D).

Unbeschädigtes Heparansulfat auf venösen Zellen nach Stimulation mit TNFα oder LPS verhindert die Komplementablagerung. (A,C) Repräsentative Bilder von Zellen, die unbehandelt (−) oder mit entweder 100 ng/ml TNFα, 100 μg/ml LPS oder 5 U/ml Heparinase (Heparinase) perfundiert wurden. Heparansulfat (HS) ist rot dargestellt, Kerne blau (DAPI). Maßstabsbalken: 50 μm. (B,D) Das Ablösen von HS wurde für jedes Bild (4 Bilder/Bedingung/Experiment) als Prozentsatz der für HS positiven Fläche quantifiziert und für die Gesamtzahl der Zellen/Bild normalisiert. (E,G) Repräsentative Bilder von Komplement C3b/c auf der Zelloberfläche von Zellen, die unbehandelt (−) oder mit entweder 100 ng/ml TNFα, 100 μg/ml LPS oder 5 U/ml Heparinase (Heparinase) perfundiert wurden. C3b/c ist in Gelb und Kerne in Blau dargestellt (DAPI). Maßstabsbalken: 50 μm (F,H) C3b/c-Ablagerung wurde als Prozentsatz der C3b/c-positiven Zellen/Gesamtzahl der Zellen/Bild (4 Bilder/Bedingung/Experiment) gemessen. Für die statistische Analyse wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit Tukey- und Bonferroni-Post-hoc-Test verwendet. Die Daten stammen aus drei oder mehr unabhängigen Experimenten mit zwei bis drei verschiedenen Schweine-EC-Spendern und wurden mit Fiji-Software analysiert.

Um zu beurteilen, ob die Persistenz von HS auf der EC-Oberfläche es den Zellen ermöglichen würde, einen entzündungshemmenden Phänotyp aufrechtzuerhalten, wurden ECs mit normalem Schweineserum (NPS) perfundiert und die Komplementablagerung wurde bewertet. Wie in Abb. 4E–H zu sehen ist, wurde eine kleine Menge C3b/c auf der Oberfläche nicht stimulierter ECs nachgewiesen. Dies wird wahrscheinlich durch die immunologische Diskrepanz zwischen den ECs und NPS verschiedener Spender verursacht. Die Stimulation arterieller Zellen mit TNFα oder LPS erhöhte die C3b/c-Ablagerung um etwa 25 % bzw. 30 % (Abb. 4F), was bestätigt, dass die Freisetzung von HS aus arteriellen Zellen mit einem Verlust entzündungshemmender Eigenschaften korreliert. Andererseits führte die Perfusion von TNFα- oder LPS-aktivierten Venenzellen mit NPS nicht zu einer Komplementablagerung (Abb. 4H), was darauf hindeutet, dass HS auf Venenzellen bei diesen Entzündungszuständen schützend wirkt. Um die Schutzfunktion von HS weiter zu bestätigen, wurden sowohl arterielle als auch venöse ECs mit Heparinase perfundiert. Wie in Abb. 4 gezeigt, reichte die enzymatische Entfernung von HS durch Heparinase (Abb. 4A–C) von der Zelloberfläche aus, um die Ablagerung von C3b/c sowohl auf arteriellen als auch venösen ECs zu induzieren (Abb. 4F, H).

Als nächstes untersuchten wir, ob der beobachtete Unterschied in der HS-Dynamik zwischen TNFα- und LPS-aktivierten arteriellen und venösen Zellen ihre Interaktion mit Leukozyten beeinflussen würde. Zu diesem Zweck wurden TNFα- oder LPS-aktivierte arterielle und venöse ECs mit fluoreszierend markierten Schweine-PBMCs perfundiert. Eine erhöhte PBMC-Bindung wurde sowohl für aktivierte arterielle als auch für venöse ECs beobachtet (Abb. 5A – C). Dies korrelierte mit der Zelloberflächenexpression von E-Selectin (ergänzende Abbildung S2B). Zusammengenommen lässt dies darauf schließen, dass HS zwar nicht von der Oberfläche venöser ECs abgegeben wird (Abb. 2C, D), die erhöhte Expression von E-Selectin jedoch ausreicht, um die PBMC-Adhäsion zu ermöglichen. Tatsächlich erhöhte die Ausscheidung von HS durch Heparinase vor der PBMC-Perfusion auf venösen Zellen die PBMC-Adhäsion nicht, wohingegen bei arteriellen Zellen die Entfernung von HS ohne vorherige Aktivierung ausreichte, um die PBMC-Bindung zu induzieren (Abb. 5A, C).

Intaktes Heparansulfat auf TNFα- oder LPS-aktivierten venösen Endothelzellen behindert die Leukozytenadhäsion nicht, schützt aber vor der Bildung von Blutgerinnseln. (A,B) Repräsentative Bilder von drei Zeitrafferaufnahmen der Bindung von mononukleären Zellen des Schweineperipherbluts (PBMCs; grün dargestellt) an (A) arterielle und (B) venöse Schweineendothelzellen, die unbehandelt (-) oder mit beiden perfundiert wurden 100 ng/ml TNFα, 100 μg/ml LPS oder 5 U/ml Heparinase (Heparinase). Zellkerne sind blau dargestellt (Hoechst). Maßstabsbalken: 50 μm. (C) Anhaftende PBMCs wurden aus 20-minütigen Zeitrafferaufzeichnungen von vier unabhängigen Experimenten quantifiziert, indem Zellen gezählt wurden, die für ≧ 3 s immobilisiert waren. (D,E) Repräsentative Bilder von Fibringerinnseln (grün), die sich auf (D) arteriellen oder (E) venösen Schweineendothelzellen bilden. Die Zellen wurden unbehandelt gelassen (–) oder entweder mit 100 ng/ml TNFα, 100 μg/ml LPS oder 5 U/ml Heparinase (Heparinase) perfundiert. Zellkerne sind blau dargestellt (Hoechst). Maßstabsbalken: 200 μm. (F) Die Zeit bis zum Verschluss wurde als vollständiger Kanalverschluss oder Zellablösung bestimmt und anhand von Zeitrafferaufzeichnungen von plasmaperfundierten Kanälen quantifiziert, die mit AlexaFluor488-markiertem Fibrinogen (grün) versetzt waren. Die Daten stammen aus vier unabhängigen Experimenten mit 2–3 verschiedenen Schweine-EC-Spendern und wurden mit Fiji-Software analysiert. (C) Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey- und Bonferroni-Post-hoc-Test oder (F) einfaktorielle ANOVA mit mehreren Vergleichen wurde für die statistische Analyse verwendet.

Da die Persistenz von HS auf venösen Zellen nach Stimulation mit TNFα oder LPS vor Komplementablagerung schützen konnte, untersuchten wir, ob auch die Gerinnselbildung beeinträchtigt wäre. Zu diesem Zweck wurden venöse und arterielle Zellen unbehandelt gelassen oder mit TNFα, LPS oder Heparinase aktiviert und dann mit rekalzifiziertem, normalem, gepooltem Schweineplasma, versetzt mit fluoreszierend markiertem Fibrinogen AlexaFluor488, perfundiert. Wie in Abb. 5D–F gezeigt, wurde die Zeit bis zur Gerinnselbildung nur bei arteriellen, nicht aber bei venösen ECs verkürzt (Abb. 5F). Dies weist darauf hin, dass HS auf venösen Zellen an der Aufrechterhaltung eines gerinnungshemmenden Zustands beteiligt ist. Da Heparinase jedoch nicht zu einer erhöhten Gerinnselbildung führt, deuten diese Daten darauf hin, dass andere Treffer, wie etwa eine Schädigung der Endothelschicht oder die Induktion der Expression des prokoagulierenden Gewebefaktors, notwendig sind, um eine Venenthrombose zu fördern.

Bei vielen entzündlichen Erkrankungen wurde eine endotheliale Glykokalyxablösung beobachtet18,22,23,27, allerdings sind die Auswirkungen der Entzündung auf arterielle oder venöse Zellen und das Ergebnis in Bezug auf die Zerstörung der Glykokalyx weitgehend unbekannt. Hier zeigen wir, dass die Glykokalyx auf venösen und arteriellen ECs unterschiedlich auf Scherbelastung und Entzündungsreize reagiert. Es ist bekannt, dass Scherspannung die Entwicklung der Glykokalyx beeinflusst41,42,43,44,45. Ein verringerter oder gestörter Fluss auf arteriellen Zellen ist nicht nur mit einem proatherogenen Phänotyp verbunden, der Atherosklerose begünstigt46,47,48, sondern auch mit einer verringerten Glykokalyxdicke49, die die Glykokalyxfunktion beeinträchtigt und Entzündungen und Koagulation verursacht. Wir fanden heraus, dass es bei arteriellen und venösen ECs von Schweinen unter verschiedenen Scherstressbedingungen eine unterschiedliche Glykokalyxdynamik gibt, insbesondere für HS. HS wird auf arteriellen Zellen nur unter Strömung exprimiert, während es auf venösen Zellen sogar unter statischen Bedingungen vorhanden ist (Abb. 1). Wir haben die Expression von Glykosaminoglykan (GAG)-Seitenketten untersucht, es ist jedoch immer noch unklar, wie Scherspannung Kernproteine ​​beeinflusst, die die Ankerpunkte für verschiedene GAG-Seitenketten sind. Es ist möglich, dass Kernproteine, die unter statischen Bedingungen exprimiert werden, durch einen anderen Satz N-substituierter (durch Anti-HS-Antikörper gefärbter) und N-unsubstituierter (durch WGA-Lectin gefärbter) Disaccharideinheiten dekoriert sind als unter Durchflussbedingungen, was das Vorhandensein von HS erklärt aber geringe Expression von GlcNAc/Sia auf venösen ECs unter statischen Bedingungen. Weitere Forschung ist erforderlich, um Kernproteine ​​zusätzlich zu spezifischen GAG-Seitenketten unter statischen und Strömungsbedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus wird die Verteilung von HS auf der Zelloberfläche durch Änderungen der Scherspannung beeinflusst. HS-Cluster an bestimmten Zellmembranregionen unter hoher Scherung, während es sich unter Bedingungen niedriger Scherung entlang der Zellverbindungen verteilt (Abb. 1). Die Umverteilung von Glykokalyxkomponenten wie Syndecan-4 zu Lipidflößen wurde von Zeng et al.41 beobachtet und soll die Aggregation von Signalmolekülen ermöglichen und die Signaltransduktion induzieren. Interessanterweise wurde auch gezeigt, dass die HS-Clusterbildung an lipidreichen Verbindungsmembranregionen den Eintritt des SARS-CoV-2-Virus in Wirtszellen erleichtert50. Daher könnten Variationen in der HS-Verteilung auf arteriellen oder venösen ECs auf eine unterschiedliche Veranlagung für Zellaktivierung oder Virusinfektion hinweisen.

Die Glykokalyxdynamik zwischen arteriellen und venösen Zellen unterscheidet sich auch bei EC-Aktivierung. In Übereinstimmung mit früheren Studien22,23,25,26,51,52,53 beobachteten wir die Freisetzung von HS von der Zelloberfläche arterieller Zellen, die mit normalem menschlichem Serum, TNFα und LPS stimuliert wurden. Überraschenderweise war HS auf venösen Zellen nicht betroffen (Abb. 2, 3), was darauf hindeutet, dass HS auf venösen ECs entweder weniger anfällig für Ausscheidung ist oder dagegen geschützt ist. Die Ausscheidung der Glykokalyx wird größtenteils durch Matrixmetalloproteinasen (MMPs) vermittelt, die in TNFα-aktivierten ECs23 und während einer Sepsis, neben anderen entzündlichen Erkrankungen, hochreguliert sind54. Die MMP-Aktivität wird physiologisch durch Gewebeinhibitoren von Matrixmetalloproteinasen (TIMPs) kontrolliert, die auch während einer Entzündung ansteigen55. Obwohl eine unveränderte Expression von MMPs und/oder eine aufrechterhaltene Aktivität von TIMPs auf venösen, aber nicht auf arteriellen Zellen für die unterschiedliche Anfälligkeit für Ausscheidungen verantwortlich sein könnten, beobachteten wir keine Veränderungen in der Expression von MMP2 und TIMP1 nach Aktivierung mit menschlichem Serum, TNFα oder LPS (Daten). nicht gezeigt). Weitere Forschung ist erforderlich, um die Expression anderer MMPs und TIMPs zu analysieren und den Mechanismus zu identifizieren, der hinter der Resistenz der venösen endothelialen Glykokalyx gegen Ausscheidung steckt.

Die Persistenz von HS auf aktivierten venösen ECs impliziert, dass bei endothelialer Aktivierung entzündungshemmende und gerinnungshemmende Eigenschaften erhalten bleiben. Dadurch sind Venen möglicherweise widerstandsfähiger gegen Gefäßschäden als Arterien. Tatsächlich zeigen wir, dass arterielle Zellen einen HS-abhängigen entzündungshemmenden und gerinnungshemmenden Phänotyp aufweisen, während das konservierte HS auf venösen Zellen beim Vergleich verschiedener Entzündungsreize zu unterschiedlichen funktionellen Ergebnissen führt. HS auf venösen Zellen schützte nur dann vor Komplementablagerung und Gerinnung, wenn TNFα oder LPS zur Endothelaktivierung verwendet wurde (Abb. 4, 5). Diese Schutzfunktion von HS wurde bei Verwendung eines Xenotransplantationsaufbaus nicht beobachtet (Abb. 2, 3). Dies könnte auf das gleichzeitige Vorhandensein mehrerer Entzündungsreize während einer Xenotransplantation zurückzuführen sein, die eine starke Entzündungsreaktion hervorrufen. Tatsächlich zeigen Wünsch et al.56, dass arterielle ECs vom Schwein im Vergleich zu klassischen proinflammatorischen Zytokinen eine anhaltende intrazelluläre Kalziumreaktion auf menschliches Serum hervorrufen.

Während Unterschiede in der Komplementablagerung auf arteriellen und venösen ECs vom Entzündungsreiz abhängig waren, trat die PBMC-Adhäsion bei beiden Zelltypen konsistent auf (Abb. 3, 5). Die Bindung von PBMC an venöse Zellen korrelierte mit der Zelloberflächenexpression von E-Selectin (ergänzende Abbildung S2), während interessanterweise auch eine Adhäsion an arterielle Zellen unter nicht entzündlichen Bedingungen beobachtet wurde, bei denen H S einfach durch Heparinase-Behandlung von der Zelloberfläche entfernt wurde. Dies legt nahe, dass die Freisetzung von HS aus arteriellen Zellen ausreicht, um die Leukozytenadhäsion zu induzieren. Ob die Behandlung mit Heparinase an Arterienzellen neben E-Selectin weitere Adhäsionsmoleküle freilegt, ist unbekannt.

Die Bedeutung der Glykokalyxablösung für die Leukozytenadhäsion ist umstritten. Einerseits kann eine intakte Glykokalyx Selektine abschirmen und die Bindung von Leukozyten verhindern, da die Dicke der intakten Glykokalyx normalerweise die Länge der Adhäsionsmoleküle übersteigt57. Andererseits bindet die Glykokalyx Chemokine, um erhöhte lokale Konzentrationen aufrechtzuerhalten und die Rekrutierung von Leukozyten zu begünstigen58. Da die Adhäsion und Extravasation von Leukozyten normalerweise in Venolen auftritt, schlagen wir vor, dass venöse ECs ihre Glykokalyx aktiv aufrechterhalten, um die Sequestrierung von Chemokinen zu begünstigen und die Rekrutierung von Leukozyten während einer Entzündung zu vermitteln. Um diese Hypothese zu überprüfen, wären Studien erforderlich, die sowohl Chemokine als auch Entzündungsreize einbeziehen. Im Gegensatz dazu könnte die HS-Abgabe an arteriellen ECs die Dicke der Glykokalyx verringern und dadurch Adhäsionsmoleküle freilegen, was zu einer erhöhten Leukozytenadhäsion führt. Interessanterweise zeigen McDonald et al.17, dass die enzymatische Entfernung der Glykokalyx aus durchflusskultivierten arteriellen ECs auch ohne einen Entzündungsreiz die ICAM-1-Expression und die Leukozytenadhäsion erhöhte. Dies legt nahe, dass die HS-Abgabe nicht nur die Dicke der Glykokalyx verringern, sondern auch zu einer erhöhten Expression von Adhäsionsmolekülen auf arteriellen ECs führen könnte. Für venöse Gefäße konnte jedoch gezeigt werden, dass die Bindung weißer Blutkörperchen ohne Glykokalyxabspaltung nach einem Entzündungsreiz erfolgte60. Dies deutet darauf hin, dass neben der Glykokalyxdicke noch weitere Faktoren eine Rolle spielen könnten, ein Beispiel ist die Glykokalyxdichte. Platts et al.61 vermuten, dass es nach einer Ischämie-/Reperfusionsverletzung zu einer „Lockerung“ der Glykokalyx der postkapillären Venolen kommt, wodurch der Fluoreszenzfarbstoff näher an die EC-Schicht vordringen kann. Dieses Phänomen könnte auch für zirkulierende Leukozyten gelten. Eine „lockerere“ Glykokalyx auf venösen ECs könnte die Bindung von PBCMs auch bei intakter Glykokalyx ermöglichen. Unsere Daten zur Glykokalyxbedeckung zeigen eine geringere Bedeckung venöser als arterieller Zellen, was darauf hindeutet, dass die venöse Glykokalyx weniger dicht und möglicherweise toleranter für die Adhäsion von Leukozyten ist. Auf arteriellen ECs, wo die Glykokalyxdichte dichter ist, werden durch die Ablösung wahrscheinlich Adhäsionsmoleküle freigelegt, die für die Leukozytenbindung verantwortlich sind.

Es ist auch bekannt, dass das Ausscheiden von Glykokalyx einen prokoagulierenden EC-Phänotyp induziert. Tatsächlich haben wir beobachtet, dass die Ausscheidung von HS aus arteriellen Zellen die Gerinnselbildung erhöht (Abb. 3, 5). Auch hier reichte die Heparinase-Behandlung aus, um diesen prokoagulierenden EC-Phänotyp zu induzieren. Im Gegensatz dazu wurde bei venösen ECs, bei denen HS erhalten blieb, eine Gerinnung nur nach xenogener Aktivierung beobachtet, während sie nach Stimulation mit TNFα oder LPS nicht auftrat (Abb. 3, 5). Obwohl proinflammatorische Zytokine und Endotoxine als prothrombotisch gelten62,63, induziert TNFα nicht direkt eine Venenthrombose64,65. TNFα-Rezeptor-Knock-out-Mäuse entwickeln auch Thromben nach der Unterbindung der Vena cava inferior65. Dies deutet darauf hin, dass Veränderungen in der Oberflächenexpression von prothrombotischen Proteinen wie dem Gewebefaktor und nicht von proinflammatorischen Zytokinen eine Venenthrombose auslösen könnten66.

Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass arterielle Zellen anfälliger für die HS-Ausscheidung sind. Tatsächlich reicht die Entfernung von HS von der arteriellen Zelloberfläche aus, um eine entzündliche und thrombotische Reaktion auszulösen. Stattdessen benötigen venöse Zellen, auf denen HS aufrechterhalten wird, zusätzlich zur Glykokalyxablösung weitere „Hits“, um ihren entzündungshemmenden und gerinnungshemmenden Phänotyp zu verlieren. Daher deutet dies darauf hin, dass venöse ECs im Vergleich zu arteriellen ECs potenziell resistenter gegen entzündliche Angriffe sind. Für verschiedene Zelltypen sollten unterschiedliche Therapieansätze in Betracht gezogen werden: Während die Wiederauffüllung von ausgeschiedenem HS bei arteriellen ECs von Vorteil wäre, sollten für venöse ECs andere Ansätze in Betracht gezogen werden, die nicht auf die Wiederherstellung der Glykokalyx abzielen. Weitere Forschung ist erforderlich, um den Mechanismus hinter der venösen HS-Ausscheidungsresistenz zu verstehen.

Während mikrofluidische Systeme für die In-vitro-Forschung immer beliebter werden, ist es wichtig zu erwähnen, dass solche Systeme immer noch von der In-vivo-Situation abweichen können. Es sollte auch hinzugefügt werden, dass sich die oben beschriebene Forschung auf makrovaskuläre ECs konzentrierte, aber auch mikrovaskuläre und organspezifische ECs analysiert werden sollten, um das aktuelle Wissen über die Heterogenität der Glykokalyxdynamik zu erweitern.

Alle relevanten Daten sind im Manuskript enthalten.

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Konfokale und Fluoreszenzmikroskopie wurde mit Geräten durchgeführt, die vom Microscopy Imaging Center (MIC) der Universität Bern, Schweiz, unterstützt wurden.

Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF) gefördert, Fördernummer 310030_182264.

Department for BioMedical Research (DBMR), Universität Bern, Murtenstrasse 24, 3008, Bern, Schweiz

Anastasia Milusev, Alain Despont, Jane Shaw, Robert Rieben & Nicoletta Sorvillo

Graduiertenschule für Zelluläre und Biomedizinische Wissenschaften (GCB), Universität Bern, Bern, Schweiz

Anastasia Milusev

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AM war für die Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Untersuchung, Methodik, Visualisierung und das Schreiben des ursprünglichen Entwurfs sowie für die Überprüfung und Bearbeitung verantwortlich. NS war für die Aufsicht verantwortlich und half bei der Konzeptualisierung, dem Verfassen des Originalentwurfs sowie der Überprüfung und Bearbeitung. RR war für die Finanzierungsbeschaffung und Ressourcen verantwortlich und half bei der Überprüfung und Bearbeitung. AD und JS halfen bei der Untersuchung.

Korrespondenz mit Nicoletta Sorvillo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Milusev, A., Despont, A., Shaw, J. et al. Entzündungsreize induzieren die Ausscheidung von Heparansulfat aus arteriellen, aber nicht aus venösen Schweineendothelzellen, was zu unterschiedlichen proinflammatorischen und prokoagulierenden Reaktionen führt. Sci Rep 13, 4483 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31396-z

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Eingegangen: 12. Dezember 2022

Angenommen: 10. März 2023

Veröffentlicht: 18. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31396-z

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