Assimilatorische Sulfatreduktion im marinen Methanogen Methanothermococcus thermolithotrophicus

Dec 16, 2023

Nature Microbiology (2023)Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Methanothermococcus thermolithotrophicus ist das einzige bekannte Methanogen, das auf Sulfat als einziger Schwefelquelle wächst und so Methanogenese und Sulfatreduktion auf einzigartige Weise vereint. Hier verwenden wir physiologische, biochemische und strukturelle Analysen, um eine Momentaufnahme des gesamten Sulfatreduktionswegs dieses methanogenen Archäons zu liefern. Wir stellen fest, dass spätere Schritte auf diesem Weg durch atypische Enzyme katalysiert werden. Das von der APS-Kinase freigesetzte PAPS (3′-Phosphoadenosin-5′-phosphosulfat) wird durch eine PAPS-Reduktase, die den APS-Reduktasen der dissimilatorischen Sulfatreduktion ähnelt, in Sulfit und 3′-Phosphoadenosin-5′-phosphat (PAP) umgewandelt. Eine nicht-kanonische PAP-Phosphatase hydrolysiert dann PAP. Schließlich wandelt die F420-abhängige Sulfitreduktase Sulfit zur zellulären Assimilation in Sulfid um. Während metagenomische und metatranskriptomische Studien darauf hindeuten, dass der Sulfatreduktionsweg in mehreren Methanogenen vorhanden ist, ist der Sulfatassimilationsweg in M. thermolithotrophicus unterschiedlich. Wir schlagen vor, dass dieser Weg durch den Erwerb assimilatorischer und dissimilatorischer Enzyme von anderen Mikroorganismen „gemischt und aufeinander abgestimmt“ wurde und dann umfunktioniert wurde, um eine einzigartige Stoffwechselrolle zu erfüllen.

Die häufigsten methanproduzierenden Mikroorganismen haben aufgrund ihrer spezifischen Enzyme und ihres Stoffwechsels einen hohen Bedarf an Schwefel. Während die meisten dieser Methanogene Sulfide (HS−) verwenden, wurde gezeigt, dass einige höhere Oxidationsstufen von Schwefel oder sogar Metallsulfide (z. B. FeS2) zur Schwefelgewinnung verstoffwechseln1,2,3,4,5. Allerdings ist Methanothermococcus thermolithotrophicus das einzige bekannte Methanogen, das auf Sulfat (\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)) als einziger Schwefelquelle wachsen kann4,6. Der Stoffwechsel dieses marinen Hydrogenotrophen, das aus geothermisch erhitzten Meeressedimenten in der Nähe von Neapel (Italien) isoliert wurde, ist paradox, da eine \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion zu mehreren führen sollte physiologische Hindernisse für eine Methan produzierende Mikrobe. Erstens gedeihen Methanogene üblicherweise in reduzierten sulfidischen Umgebungen, in denen alle Elektronenakzeptoren außer CO2 erschöpft sind, einschließlich \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (Lit. 7,8). Zweitens müssen an der Grenzfläche, an der Methanogene und \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Ionen koexistieren, hydrotrophe Methanogene mit dissimilatorischen \({{\rm{SO}}}-Ionen konkurrieren. _{4}^{2-}\)-reduzierende Mikroorganismen für das gemeinsame Substrat Diwasserstoff (H2)9. Drittens leben Methanogene an den thermodynamischen Grenzen des Lebens und die mit der \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion gekoppelte Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) wäre hierfür eine erhebliche Investition energiebegrenzte Mikroorganismen8,10. Schließlich erzeugt der \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktionsweg toxische Zwischenprodukte, die zelluläre Prozesse stören würden.

Um \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) zu assimilieren, müsste der Organismus das Anion einfangen und es mithilfe eines Transporters in die Zelle transportieren. Innerhalb der Zelle wird \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) durch eine ATP-Sulfurylase (ATPS) aktiviert, um Adenosin-5′-phosphosulfat (APS) zu erzeugen11,12,13 . Von dort aus können Organismen verschiedene Strategien anwenden (Extended Data Abb. 1, Routen a–c): (1a) APS wird direkt durch eine APS-Reduktase (APSR) reduziert, um AMP zu erzeugen und \({{\rm{SO}}} _{3}^{2-}\). (1b) Alternativ kann APS durch die APS-Kinase (APSK) weiter zu 3′-Phosphoadenosin-5′-phosphosulfat (PAPS) phosphoryliert werden. Eine PAPS-Reduktase (PAPSR) reduziert PAPS zu \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) und dem toxischen Nukleotid 3'-Phosphoadenosin-5'-phosphat (PAP). PAP muss durch eine PAP-Phosphatase (PAPP) schnell zu AMP und anorganischem Phosphat hydrolysiert werden. In beiden Szenarien wird der letzte Schritt durch eine Sirohem-haltige Sulfitreduktase ausgeführt, die \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) zu HS− reduziert. Letzteres kann dann in Biomasse eingearbeitet werden. (1c) Auf einem anderen Weg wird die Sulfitgruppe von PAPS auf einen anderen Akzeptor übertragen, um sulfatierte Metaboliten aufzubauen. Route 1a ist dem dissimilatorischen Weg sehr ähnlich (Extended Data Abb. 1, Route 2). Dissimilatorische APSRs und dissimilatorische Sulfitreduktasen unterscheiden sich jedoch strukturell und phylogenetisch von ihren assimilatorischen Gegenstücken und koppeln ihre Reaktionen indirekt an Membranpumpen, was eine Energieeinsparung ermöglicht14,15,16.

Gene, die mutmaßliche Enzyme kodieren, die mit der \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion assoziiert sind, wurden in den Genomen mehrerer Methanogene13, einschließlich M. thermolithotrophicus, gefunden. Für dieses Methanogen kann ein theoretischer, wenn auch unvollständiger \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Assimilationsweg angenommen werden. Hier haben wir die komplette \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktionsmaschinerie dieses Archäons aufgeklärt und beschrieben, wie dieses eine Methanogen \({{\rm{SO}} }_{4}^{2-}\) in einen elementaren Lebensblock.

Auf Na2S gewachsene Kulturen wurden nacheinander in ein schwefelfreies Medium überführt, bis kein Wachstum mehr zu beobachten war. M. thermolithotrophicus zeigte ein robustes Wachstum, wenn dem Medium mindestens 100 µM Na2SO4 zugesetzt wurden, und erreichte ähnliche Zellausbeuten wie die mit Na2S gezüchtete Kultur. Unter diesen Kultivierungsbedingungen wird \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) mit zunehmender Zelldichte im Laufe der Zeit verbraucht (Abb. 1a). Wenn Zellen nur auf Na2S gezüchtet werden, konnte kein \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) nachgewiesen werden (Abb. 1a), was darauf hinweist, dass M. thermolithotrophicus keine Sulfidoxidation durchführt .

a: M. thermolithotrophicus-Kulturen, gewachsen auf Na2S (schwarze Quadrate, 0,5 mM) und Na2SO4 (graue Quadrate, 0,5 mM). Der Verbrauch oder die Freisetzung von \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) in Na2S- oder Na2SO4-Kulturen wird durch schwarze bzw. graue Dreiecke dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und einzelne Werte werden als Kugeln dargestellt (n = 3 Wiederholungen). Es wird davon ausgegangen, dass Unterschiede zwischen der erwarteten (0,5 mM) und der gemessenen (0,13 mM) \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Konzentration für den Anfangspunkt auf ein Artefakt zurückzuführen sind Medium (siehe Methoden). b, M. thermolithotrophicus, gezüchtet auf 10 mM Na2SO4 in drei unabhängigen Fermentern. Die Abtastpunkte werden durch graue Quadrate dargestellt. c, Molybdat (Na2MoO4) Hemmung der Na2SO4 assimilierenden und dissimilatorischen Archaeen. Wachstumsexperimente für M. thermolithotrophicus wurden doppelt und für A. fulgidus vierfach (links) oder dreifach (rechts) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert und für die Dreifach- und Vierfachbestimmungen ± sd d dargestellt. Voraussichtliches Operon für \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion aus der Gesamtgenom-Shotgun-Sequenz von M . thermolithotrophicus.

Quelldaten

Anschließend haben wir die mit \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) gezüchtete Kultur herausgefordert, indem wir von Batch- auf Fermenterbedingungen umgestellt haben, bei denen H2S in die Gasphase entweichen kann und sich im Vergleich dazu nicht ansammelt zu Kolbenbedingungen. In diesem offenen System mit kontrollierter Temperatur und pH-Wert wuchs M. thermolithotrophicus innerhalb von 19 Stunden auf eine maximale optische Dichte (OD) von 600 nm von 6,45 (Abb. 1b).

Eine Möglichkeit zu bestimmen, ob M. thermolithotrophicus auf kanonischen Enzymen des \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktionswegs beruht, ist die Verwendung von Molybdat (\({{\rm{ MoO}}}_{4}^{2-}\)). Das Strukturanalogon von \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) bindet an das ATPS und löst eine Molybdolyse aus, die ATP zu AMP und Pyrophosphat (PPi) hydrolysiert, was zu einem zellulären Energieabbau führt17 ,18. Ein \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) Molverhältnis von 0,004 :1 reicht aus, um die Aktivität dissimilatorischer \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-reduzierender Bakterien für 168 Stunden zu hemmen, ein Effekt, der hauptsächlich auf die Molybdolyse durch ATPS zurückzuführen ist19,20, 21. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) Die Assimilation wird auch durch \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) beeinflusst. wie Studien an Pflanzen zeigen22. Im letzteren Fall trat eine Wachstumshemmung auf, wenn \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) im Vergleich zu \({{\rm{SO}}}_{4} im Überschuss vorlag. ^{2-}\) und die ATPS-Aktivität wurde deutlich im Verhältnis 1:1 beeinflusst18. Bei der Anwendung auf M. thermolithotrophicus störte ein hohes \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):Na2S-Verhältnis von 12,5:1 das Wachstum der Na2S-Kultur nicht, was darauf hinweist, dass \ ({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) beeinträchtigt ihren Grundstoffwechsel nicht. Im Gegensatz dazu ist ein \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Verhältnis von 6,25:1 wirkte hemmend auf die mit \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) gezüchtete Kultur, während ein Verhältnis von 1:1 dies nicht tat (Abb. 1c und Extended Data Abb . 2a). \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) Ergänzung zur \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\)-inhibierten Kultur wiederhergestelltes Wachstum (Extended Data Abb. 2b), was auf die Reversibilität der Hemmung und ihre strikte Kontrolle durch \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm {SO}}}_{4}^{2-}\)-Verhältnis und nicht die \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\)-Konzentration. Im Vergleich dazu beobachteten wir bei Archaeoglobus fulgidus, einem Archäon, das eine dissimilatorische \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion durchführt, um Energie zu sparen, eine Wachstumshemmung bei einem \({{\ rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) Verhältnis von 0,001:1 (Abb. 1c und Erweiterte Daten Abb. 2c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass M. thermolithotrophicus \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) über einen Assimilationsweg reduziert, der ein funktionelles ATPS enthält. Gene, die für mutmaßlich eigenständiges ATPS und APSK kodieren, befanden sich tatsächlich am selben Ort im Genom des Stammes DSM2095, den wir neu sequenziert hatten (Abb. 1d) (Lit. 13, 23). Um ihre Funktionen zu bestätigen, wurden ATPS und APSK von M. thermolithotrophicus (MtATPS bzw. MtAPSK) weiter charakterisiert.

Die Aktivität des rekombinant exprimierten MtATPS und MtAPSK wurde über einen gekoppelten Assay getestet (Abb. 2a und ergänzende Abb. 1) und eine spezifische Aktivität von 0,070 ± 0,004 µmol oxidiertem NADH min−1 mg−1 MtATPS gemessen. Unter diesen Bedingungen war die Pyrophosphataseaktivität der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Dies unterstreicht die Notwendigkeit eines schnellen Pyrophosphatabbaus (Abb. 2a), um eine Retrohemmung zu vermeiden, wie zuvor für andere ATPS24 gezeigt. Ein \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) Verhältnis von 1: 1,25 verringerte die Aktivität um die Hälfte (siehe Methoden), was bestätigt, dass ATPS auch mit \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) reagiert, wie in anderen Homologen gezeigt18,21.

a, oberes Feld, durch MtATPS und MtAPSK katalysierte Reaktionen; Unten: die spezifische Aktivität von MtATPS und MtAPSK, bestimmt über einen gekoppelten Enzymassay. „-“ zeigt die Abwesenheit des angegebenen Reaktanten an. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und einzelne Werte werden als graue Kugeln angezeigt (n = 3 Wiederholungen). b, homodimere MtATPS-Struktur, in der ein Monomer als hellgelbe Oberfläche und das andere als Cartoon dargestellt ist. c, Aktives Zentrum von MtATPS (gelb), überlagert mit dem ATPS von Thermus thermophilus HB8 (PDB: 1V47, grau), das das APS enthält, dargestellt als Kugeln und Stäbchen mit cyanfarbenen Kohlenstoffen. Rückstände, die an der Substratbindung beteiligt sind, werden in den Stäbchen hervorgehoben und nur diejenigen von MtATPS werden markiert. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem ATPS von T. thermophilus und APS sind als gestrichelte Linien dargestellt. Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor und Schwefel sind jeweils in Blau, Rot, Orange und Gelb gefärbt. d, Sequenzkonservierung über ATPS-Homologe hinweg. e, homodimere MtAPSK-Struktur, in der ein Monomer in hellorangefarbener Oberfläche und das andere im Cartoon dargestellt ist. Die durch die gestrichelte Linie dargestellte flexible Schleife konnte nicht modelliert werden. In allen Strukturen werden die N- und C-Termini durch eine blaue bzw. rote Kugel dargestellt. f, Sequenzkonservierung über APSK-Homologe hinweg. Für d und f sind rote fette Reste an der Substratbindung beteiligt, während rote und schwarze Sterne jeweils perfekt bzw. gut konservierte Reste sind.

Quelldaten

Die Struktur von MtATPS wurde auf eine Auflösung von 1,97 Å verfeinert und trotz Cokristallisation mit APS und \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) im Apo-Zustand erhalten (Erweiterte Datentabelle 1). ). Während die Kristallpackung auf eine homotetramere Anordnung in zwei kristallinen Formen schließen lässt, bestätigten Größenausschlusschromatographie und Oberflächenanalyse mittels PISA (www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/) einen homodimeren Zustand, der bakteriellen Homologen ähnelt (Extended Data Abb. 3a und). Ergänzende Abbildung 2). Die Struktur weist die typische ATPS-Faltung auf, die aus drei Domänen besteht (Domäne I, 1–156; Domäne II, 164–314 und Domäne III, 320–382; Abb. 2b). Die dimere Schnittstelle ist hauptsächlich durch Domäne III organisiert, wie bei T. thermophilus beobachtet, ein bemerkenswerter Unterschied im Vergleich zu anderen Strukturhomologen (Extended Data Abb. 3a, b) (Lit. 25, 26, 27). Ähnlich wie bei vielen thermophilen Bakterien und Archaeen enthält die Domäne III eine zinkbindende Domäne (320–343; erweiterte Daten Abb. 3c, d), die zur thermischen Stabilität beitragen könnte . Die Überlagerung von MtATPS mit Strukturhomologen zeigt eine leichte Domänenumlagerung, die wahrscheinlich auf das Fehlen von Substrat zurückzuführen ist (Extended Data Abb. 3b). Alle für die Reaktion kritischen Reste sind in MtATPS konserviert, was für einen konservierten Reaktionsmechanismus spricht (Abb. 2c, d, Extended Data Abb. 3e, f und 4a und ergänzende Abb. 3).

Das APS-Kinase-Modell von M. thermolithotrophicus, MtAPSK, wurde auf 1,77 Å verfeinert. MtAPSK bildet ein Homodimer mit einer Organisation, die bakteriellen Enzymen sehr ähnlich ist, was aufgrund seiner hohen Sequenzkonservierung zu erwarten war (Extended Data Abb. 4b und 5a). Trotz Cokristallisation und Tränken der Kristalle mit APS und MgCl2 wurde die MtAPSK-Struktur in ihrem Apo-Zustand mit einem gebundenen Phosphat an der erwarteten Position des ATP-β-Phosphats erhalten (Abb. 2e und erweiterte Daten Abb. 5b, c). Der N-Terminus und die Region 125–152 (letztere ist an der Substratbindung28,29 beteiligt) konnten aufgrund der fehlenden Elektronendichte nicht modelliert werden. Die Reste, die die Substrate und Mg2+ binden, bleiben jedoch erhalten (Abb. 2f, erweiterte Daten Abb. 5b, c und ergänzende Abb. 4), was darauf hindeutet, dass MtAPSK funktionsfähig sein sollte, wie durch den gekoppelten Enzymtest bestätigt.

Wenn ATPS und APSK aktiv sind, produzieren sie PAPS, ein Zwischenprodukt, das den Stoffwechselwegen 1b oder 1c folgen könnte (Extended Data Abb. 1). Beide Wege führen zur Produktion des toxischen Produkts PAP, das Sulfotransferasen und Exoribonukleasen hemmt und den RNA-Katabolismus stört30,31. Daher muss es durch eine PAP-Phosphatase effizient hydrolysiert werden. Während das Genom keine verwandte PAP-Phosphatase enthielt, wurde in der genomischen Umgebung ein Gen gefunden, das für eine mutmaßliche Phosphoesterase kodiert (Abb. 1d), das die ATPS- und APSK-Gene beherbergt. Dieser PAP-Phosphatase-Kandidat, der zur DHH-Familie gehört, wurde rekombinant exprimiert und produzierte anorganisches Phosphat (Pi) aus PAP mit hoher Geschwindigkeit (50,2 ± 5,9 µmol Pi setzten min-1 mg-1 gereinigtes Enzym mit Mangan frei). Die Aktivität wurde durch Manganzugabe stimuliert und zeigte eine hohe Spezifität gegenüber PAP (Abb. 3a).

a, oberes Bild, durch MtPAPP katalysierte Reaktion; Unten: spezifische Aktivität des MtPAPP, bestimmt über die Produktion von Pi (links) und relative enzymatische Aktivität gegenüber verschiedenen Nukleotiden (rechts). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und einzelne Werte werden als graue Kugeln angezeigt (n = 3 Wiederholungen). b, Organisation von MtPAPP in Cartoon-Darstellung. Die N- und C-Termini werden als blaue bzw. rote Kugeln hervorgehoben. Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Phosphor von AMP sind in den Farben Cyan, Blau, Rot und Orange gefärbt. c, Nahaufnahme des aktiven Zentrums von MtPAPP. Die Reste, die das AMP- und Mn2+-Ion koordinieren, werden durch Stäbchen hervorgehoben und wie in b gefärbt, wobei die Reste des DHH-Motivs rosa gefärbt sind. d, Schnittansicht der MtPAPP-Struktur, dargestellt in Oberflächendarstellung und gefärbt durch ihre Sequenzkonservierung über 168 archaische Homologe hinweg. Der Farbverlauf reicht von variabel (blaugrün) bis konserviert (magenta). e: Die Darstellung der Sekundärstruktur erfolgte mit ESPript 3.0 (Lit. 61). Der farbige Rahmen entspricht den verschiedenen Domänen: DHH-Domäne in Hellgrün, Linker in Grau und DHHA1-Domäne in dunklerem Grün. Perfekt und gut konservierte Reste in 168 archaeischen Homologen werden in Rot bzw. Gelb hervorgehoben. Die Sekundärstrukturen, aus denen sich MtPAPP zusammensetzt, sind beschriftet, wobei β-Faltblätter, α-Helices und β-Windungen jeweils als Pfeile, Federn und fettes TT hervorgehoben sind.

Quelldaten

Um den Mechanismus dieser unkanonischen PAP-Phosphatase (MtPAPP genannt) zu entschlüsseln, wurde das Enzym zusammen mit Mangan und PAP kristallisiert. Die durch molekularen Ersatz mit einem von AlphaFold2 (Ref. 32,33) erzeugte Matrize gelöste Struktur wurde auf eine Auflösung von 3,1 Å verfeinert und enthielt das Produkt AMP und ein Ion in seinem aktiven Zentrum, modelliert als teilweise besetztes Mn2+ (Extended Data Table). 1). Während die MtPAPP-Sequenz nicht mit Homologen der DHH-Familie übereinstimmt (mit Ausnahme des DHH-Motivs), weist sie eine Gesamtfaltung auf, die der Exonuklease RecJ oder der Oligoribonuklease NrnA aus Bacillus subtilis (BsNrnA, die ebenfalls PAP-Phosphatase-Aktivität aufweist) ähnelt; Erweiterte Daten Abb. 6a) (Ref. 34,35,36). Das Monomer besteht aus einer N-terminalen (DHH, Reste 1–180) und einer C-terminalen Domäne (DHHA1, Reste 211–315), die durch eine Linkerregion (Reste 181–210) miteinander verbunden sind und eine zentrale Furche bilden (Abb. 3b). Die DHH-Domäne enthält die katalytische Stelle und die DHHA1-Domäne dient als Gerüst, um das Substrat mit hoher Spezifität zu binden (Abb. 3b, c und erweiterte Daten Abb. 6b). Das Motiv, das das Mn2+-Ion in RecJ und BsNrnA koordiniert, ist in MtPAPP34,36 perfekt konserviert, daher gehen wir davon aus, dass MtPAPP in seinem aktiven Zustand mit zwei Mn2+ beladen wäre. Der erste, der teilweise in der Struktur beobachtet wird, wird von vier Aspartaten (Asp8, Asp10, Asp57, Asp127) und einer weitreichenden Wechselwirkung mit His6 koordiniert. Das fehlende zweite Mn2+ würde durch Asp10, Asp57, Asp127, das DHH-Motiv (His76, His77) sowie durch Wassermoleküle koordiniert (Extended Data Abb. 6c). Während das AMP eine ähnliche Lokalisierung mit Strukturhomologen (β9β10β11) aufweist, ist es durch eine andere Wechselwirkung mit dem Protein gebunden (Extended Data Abb. 6b und Supplementary Abb. 5). Die Nukleotidbindungsstelle würde idealerweise das 3'-Phosphat des PAP vor dem Mangan platzieren, wenn sich das Enzym in seinem geschlossenen Zustand befindet (Extended Data Abb. 6c). Die durch den Linker ermöglichte Bewegung zwischen Domänen würde einen schnellen Austausch des Substrats/Produkts erleichtern und den Umsatz von MtPAPP erhöhen. Die vollständige Sequenz dieser PAP-Phosphatase wurde im Genom von 168 Archaeen gefunden, in denen die Nukleotidbindungsstelle konserviert ist (Abb. 3d, e und ergänzende Abb. 6). Dies deutet auf ein in Archaeen verbreitetes Enzym zur Entgiftung von PAP hin (Extended Data Abb. 7a).

Im Genom von M. thermolithotrophicus wurden keine Gene gefunden, die für eine kanonische PAPS-Reduktase (Route 1b) oder Sulfotransferase (Route 1c) kodieren. Es sind jedoch Gene vorhanden, die als dissimilatorische APS-Reduktase (α- und β-Untereinheit, APSR; Extended Data Abb. 7b und Supplementary Abb. 7) bezeichnet sind und zusammen mit den zuvor beschriebenen Genen auftreten (Abb. 1d).

Um die Aktivität und Substratspezifität dieses APS-Reduktase-ähnlichen Enzyms experimentell zu bestätigen, wurden beide Untereinheiten in Escherichia coli coexprimiert, gereinigt und für Enzymaktivitätstests getestet (Abb. 4a). Im Gegensatz zu dissimilatorischen APSRs, die die reversible Reduktion von APS zu AMP und \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (Lit. 37,38) katalysieren, konnten wir dies nicht messen Rückreaktion (d. h. AMP und \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) oder PAP und \({{\rm{SO}}}_{3}^ {2-}\) als Substrate) für das M. thermolithotrophicus-Enzym unter Verwendung von K3Fe(CN)6 als Elektronenakzeptor. Stattdessen verwendeten wir einen gekoppelten Enzymassay, um den Signalweg in vitro wiederherzustellen (Extended Data Abb. 8). MtATPS, eine Pyrophosphatase und MtAPSK wurden zur Erzeugung von PAPS verwendet und MtPAPP wurde hinzugefügt, um PAP, einen potenziellen Retroinhibitor der Reaktion, zu entfernen39. Die Aktivität wurde über die Oxidation von reduziertem Methylviologen (MVred) überwacht. Wenn alle Komponenten vorhanden waren, wurde eine spezifische enzymatische Aktivität von 0,114 ± 0,007 µmol oxidiertes MV min−1 mg−1 des APS-Reduktase-ähnlichen Enzyms gemessen. Ein fünffacher Überschuss des APS-Reduktase-ähnlichen Enzyms führte zu einem Anstieg der spezifischen Enzymaktivität um 220 %, was darauf hindeutet, dass das Enzym der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion war (Extended Data, Abb. 8c). Allerdings hemmte die Akkumulation von PAP (induziert durch die Entfernung von MtPAPP oder Mn2+) die Aktivität stark. Die spezifische enzymatische Aktivität mit APS als Substrat (d. h. Entfernung von MtAPSK) betrug 0,007 ± 0,001 µmol oxidiertes MV min−1 mg−1 des APS-Reduktase-ähnlichen Enzyms (Abb. 4a). Angesichts der Komplexität dieses gekoppelten Enzymassays konnten keine kinetischen Parameter bestimmt werden. Der Assay lieferte jedoch Erkenntnisse über die Substratspezifität und bestätigte, dass das APS-Reduktase-ähnliche Enzym aus M. thermolithotrophicus Merkmale einer PAPS-Reduktase aufweist.

a, oberes Bild, durch MtPAPSR katalysierte Reaktion; Unten: relative Enzymaktivität von MtPAPSR, bestimmt über einen gekoppelten Enzymtest (Extended Data Abb. 8). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und einzelne Werte werden als graue Kugeln angezeigt (n = 3 Wiederholungen). b, MtPAPSR-Organisation mit einem Heterodimer in Oberflächendarstellung und dem anderen in Cartoon. Die N- und C-Termini beider Untereinheiten sind als Kugeln dargestellt und blau bzw. rot gefärbt. Heterodimere Partner werden mit einem Strich gekennzeichnet. Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Eisen und Schwefel sind jeweils in den Farben Zitrone, Blau, Rot, Orange, Braun und Gelb gefärbt. c, Nahaufnahme der Cofaktoren und des Elektronenflusses. [4Fe-4S]-Cluster und sie koordinierende Cysteine, FAD und das Trp42, von dem angenommen wird, dass es am Elektronentransfer beteiligt ist, sind in Stäbchen und Kugeln dargestellt und wie in b gefärbt. d,e, Aktive Stellen von APSR (d) aus A. fulgidus mit APS (AfAPSR, PDB: 2FJA) und MtPAPSR mit einem künstlich modellierten PAPS (e), dargestellt mit transparenter Oberfläche. Rückstände, die an der Substraterkennung beteiligt sind (basierend auf modellierten PAPS), liegen in Kugeln und Stäbchen vor und sind wie in b gefärbt. Ein roter Pfeil zeigt an, wo PAPS kollidieren würden. f, Sequenzkonservierung über die Alpha-Untereinheit von MtPAPSR, AfAPSR, Megalodesulfovibrio gigas (DgAPSR, PDB: 3GYX) und das mutmaßliche APSR von Caldanaerobius fijiensis (CfAPSR, WP_073344903), das 68 % Sequenzidentität mit MtPAPSR teilt. Reste, die an der APS-Bindung für APSR beteiligt sind, sind fett und rot; Perfekt und gut konservierte Reste werden mit roten bzw. schwarzen Sternen hervorgehoben. Trp206 und Tyr207 sind an der FAD-Bindung beteiligt. Das Sequenz-Alignment wurde mit MUSCLE62 durchgeführt.

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Um weitere molekulare Einblicke in das unkonventionelle APS-Reduktase-ähnliche Enzym aus M. thermolithotrophicus zu gewinnen, wurde das Enzym unter anaeroben Bedingungen kristallisiert. Die Struktur wurde durch ein anomales Dispersionsexperiment bei einer Wellenlänge gelöst, das an der Fe-K-Kante gemessen und auf eine Auflösung von 1,45 Å verfeinert wurde (erweiterte Datentabelle 1). Der Komplex organisiert sich als α2β2-Heterotetramer mit der gleichen Anordnung wie dissimilatorische APS-Reduktasen (Abb. 4b und erweiterte Daten Abb. 9). Es unterscheidet sich jedoch drastisch von den charakterisierten Einzeldomänen-assimilatorischen APS/PAPS-Reduktasen, die Thioredoxin/Glutathion-abhängig sind. Assimilatorische APS/PAPS-Reduktasen haben keine Sequenz oder strukturelle Homologie mit dem M. thermolithotrophicus-Enzym, und mehrere Motive, von denen angenommen wird, dass sie die Substratbindung und die katalytische Aktivität in assimilatorischen APS/PAPS-Reduktasen vermitteln, fehlen (Erweiterte Daten, Abb. 9) (Ref. 40). ).

In M. thermolithotrophicus ist die α-Untereinheit, die das Flavinadenindinukleotid (FAD) enthält, ein Mitglied der Familie der Fumaratreduktasen37,41,42 und die β-Untereinheit besteht hauptsächlich aus einer Ferredoxin-ähnlichen Domäne, in der zwei [4Fe-4S ]-Cluster werden von acht Cysteinresten koordiniert (Abb. 4c). Obwohl es keine assimilatorischen P/APS-Reduktase-Homologen zum M. thermolithotrophicus-Enzym gibt, weist es eine Sequenzidentität von 38 % mit der α-Untereinheit der dissimilatorischen APS-Reduktase aus A. fulgidus auf (AfAPSR PDB: 2FJA, RMSD von 1,02 Å für 437 Cα ausgerichtet auf der α-Untereinheit). Die APS koordinierenden Reste, die in der dissimilatorischen Familie unveränderlich sind, unterscheiden sich in M. thermolithotrophicus und könnten einen Wechsel der Spezifität von APS zu PAPS hervorrufen. Trotz eines kurzen Einweichens in PAP enthält die mutmaßliche Substrattasche nur Lösungsmittel, und wir haben AfAPSR verwendet, um PAPS im aktiven Zentrum des Enzyms künstlich zu modellieren (Abb. 4d, e). Die verschiedenen Substitutionen, die hauptsächlich von der Schleife 104–123 getragen werden, würden die zusätzliche 3′-Phosphatgruppe durch Salzbrückenwechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen aufnehmen (Abb. 4d – f). In APS-Reduktasen würde jedoch ein konserviertes Glutamin (α145 in A. fulgidus) mit dieser Phosphatgruppe kollidieren. Die in dissimilatorischen APS-Reduktasen vorgeschlagenen katalytischen Reste bleiben im Enzym von M. thermolithotrophicus erhalten (erweiterte Daten, Abb. 9 und ergänzende Abb. 7). Wir schlagen daher einen identischen Reaktionsmechanismus vor, der auf einem nukleophilen Angriff des Atoms N5 von FAD auf das Schwefel-PAPS basiert, wodurch ein FAD-PAPS-Zwischenprodukt entsteht, das in PAP und FAD-\({{\rm{SO}}} zerfällt. _{3}^{2-}\) (Lit. 37,42). Unter Berücksichtigung der Enzymraten und der Strukturanalyse schlagen wir vor, dass M. thermolithotrophicus eine einzigartige Klasse von PAPS-Reduktasen (MtPAPSR) beherbergt, die zur Umwandlung von PAPS in \({{\rm{SO}}}_{3}^{2- }\) und PAP.

Das von MtPAPSR erzeugte \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) muss weiter auf HS− reduziert werden. In hydrotrophen Methanogenen schädigt \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) die methanerzeugende Maschinerie und muss durch die F420-abhängige Sulfitreduktase (Fsr)23,43 entgiftet werden. Wir haben zuvor Fsr der Gruppe I in M. thermolithotrophicus (MtFsr) identifiziert und charakterisiert und eine robuste enzymatische Aktivität gegenüber \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) festgestellt (Lit. 23). Außer einer zweiten Fsr-Isoform enthält M. thermolithotrophicus keine weiteren potenziellen Sulfitreduktasen. Während die Massenspektrometrie bestätigte, dass das aus mit \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) gewachsenen Zellen isolierte Fsr das charakterisierte MtFsr der Gruppe I ist, bleibt die physiologische Rolle der zweiten Fsr-Isoform bestehen unbekannt23. Daher ist MtFsr der beste Kandidat, um die endgültige Reduktion von \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) zu HS− zu katalysieren. Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (native PAGE) mit Zellextrakten von Kulturen, die auf verschiedenen Schwefelsubstraten gezüchtet wurden, bestätigte die Abwesenheit von MtFsr in auf Na2S gezüchteten Zellen und dessen hohe Häufigkeit in auf \({{\rm{SO}}}_{3 gezüchteten Zellen }^{2-}\) (Lit. 23,43).

Wir ermittelten eine spezifische Sulfitreduktaseaktivität von 18,42 ± 0,13 µmol oxidiertes MV min−1 mg−1 Zellextrakt aus mit Na2SO3 gezüchteten Zellen im Vergleich zu 7,31 ± 0,63 µmol oxidiertes MV min−1 mg−1 Zellextrakt aus Mit Na2SO4 gezüchtete Zellen, wohingegen Zellextrakt aus einer mit Na2S gezüchteten Kultur eine spezifische Sulfitreduktaseaktivität von 3,04 ± 0,25 µmol oxidiertes MV min−1 mg−1 aufwies (Abb. 5a). Übereinstimmend beobachteten wir eine mit Fsr kompatible Bande auf der nativen PAGE für die mit \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) angebaute Kultur, jedoch in geringeren Mengen im Vergleich zu \({ {\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) Bedingungen (Abb. 5b). Die kürzlich von unserer Gruppe veröffentlichte MtFsr-Struktur wurde aus mit \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) gezüchteten Zellen erhalten, was bestätigte, dass es sich um dasselbe Enzym handelt, das unter \( {{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) Bedingungen23. Zusammengenommen sprechen diese Ergebnisse dafür, dass MtFsr als letztes Enzym im \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktionsweg verwendet wird (Abb. 5c).

a, Sulfit-Reduktase-Aktivität im Zellextrakt von M. thermolithotrophicus, der auf verschiedenen Schwefelquellen gezüchtet wurde. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und einzelne Werte werden als graue Kugeln dargestellt (n = 3 biologisch unabhängige Replikate). b, hrCN-Gel mit M. thermolithotrophicus-Zellextrakt, gewachsen auf verschiedenen Schwefelquellen (15 µg Protein pro Probe, n = 2 biologisch unabhängige Duplikate). c, Vorgeschlagener \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Assimilationsweg in M. thermolithotrophicus. Gelbe und graue Hintergründe heben die \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktions- bzw. Methanogenesewege hervor. Dicke Pfeile weisen auf hohe Stoffwechselflüsse hin. Die Strukturen der Enzyme, die den \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Assimilationsweg betreiben, werden in Oberflächendarstellung dargestellt, mit Liganden als Kugeln und Stäbchen. Enzyme werden wie folgt abgekürzt: Fwd/Fmd, Formylmethanofuran-Dehydrogenasen; Ftr, Tetrahydromethanopterin (H4MPT)-Formyltransferase; Mch, Methenyl-H4MPT-Cyclohydrolase; Mtd, Methylen-H4MPT-Dehydrogenase; Mer, 5,10-Methylen-H4MPT-Reduktase; Mtr, N5-CH3-H4MPT: Coenzym M Methyltransferase; Mcr, Methyl-Coenzym-M-Reduktase; Adk, Adenylatkinase; Frh, F420-reduzierende [NiFe]-Hydrogenase; Eha/Ehb, energieumwandelnde Hydrogenase. Als mutmaßliche \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Transporter der Klasse DASS/SUIP werden WP_018154444/WP_018154062 und die Pyrophosphatase WP_018154121 vorgeschlagen.

Quelldaten

Methanogene nutzen üblicherweise HS− als Schwefelquelle, und diejenigen, die den Fsr-Typ I exprimieren, können auch auf \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) wachsen (Lit. 13,23 ,43). Interessanterweise verfügen einige Methanogene über Gene, die für Proteine ​​des vollständigen oder teilweisen \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktionswegs kodieren (Ergänzende Abbildung 8) (Lit. 13) . Warum ist M. thermolithotrophicus bisher das einzige Methanogen, das nachweislich auf \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) wächst? Um dies weiter zu untersuchen, verwendeten wir Methanocaldococcus infernus als Modellorganismus. M. infernus ist ein mariner Hyperthermophiler, der eine sehr ähnliche Physiologie wie M. thermolithotrophicus aufweist und im gleichen Medium wachsen kann. Es enthält alle Gene, die für die in dieser Studie charakterisierten Enzyme kodieren, mit Ausnahme des beschriebenen PAPSR. Das Genom von M. infernus kodiert jedoch für ein mutmaßliches Thioredoxin-abhängiges PAPSR und APSR, das hohe Sequenzidentitäten mit dem biochemisch charakterisierten assimilatorischen APSR und PAPSR von M. jannaschii aufweist (Abb. 6a und erweiterte Daten Abb. 7b) (Lit. 44). ,45). Basierend auf genomischen Informationen sollte M. infernus daher in der Lage sein, \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) zu assimilieren.

a, Methanocaldococcus infernus hat das genomische Potenzial, den gesamten \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Assimilationsweg durchzuführen. WP_013099421 hat eine Aminosäuresequenzidentität von 59,68 % mit MtPAPP, WP_013099422 hat eine Sequenzidentität von 70,60 % mit MtATPS und WP_157198836 hat eine Sequenzidentität von 75,44 % mit MtAPSK. APSR (WP_013100115) und PAPSR (WP_013099852) ähneln den biochemisch charakterisierten APSR und PAPSR von M. jannaschii (68,64 % bzw. 58,35 % Aminosäuresequenzidentität), die nachweislich APS/PAPS reduzieren44,45. WP_013099852 ist nicht homolog zu MtPAPSR, aber homolog zu WP_018154242, einer mutmaßlichen PAPS-Reduktase in M. thermolithotrophicus. WP_013100746 weist eine Sequenzidentität von 65,30 % mit MtFsr der Gruppe I auf. b, Wachstum von M. thermolithotrophicus und M. infernus auf 2 mM Na2S, ohne zusätzliche Schwefelquelle, 2 mM Na2SO3, 2 mM Na2SO4 oder 2 mM Na2SO4 mit 2 mM Na2S. Das \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) in Klammern zeigt an, dass es als Schwefelsubstrat für das Inokulum verwendet wurde. Dargestellt sind die maximalen OD600 nm der Kulturen in dreifacher Ausführung, dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung. M. infernus-Kulturen, die ohne Schwefel, Na2SO4 und auf Na2S mit Na2SO4 gewachsen sind, sind in doppelter Ausführung dargestellt. Der einzelne Datenpunkt jedes Replikats wird als Kugel dargestellt.

Quelldaten

M. thermolithotrophicus und M. infernus wurden im gleichen Medium und unter den gleichen Kultivierungsbedingungen gezüchtet, außer dass M. infernus bei 75 °C gehalten wurde und M. thermolithotrophicus bei 65 °C. Infernus wuchs auf 2 mM Na2S und Na2SO3, konnte dies aber nicht verwenden Sie \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) als einzige Schwefelquelle im Gegensatz zu M. thermolithotrophicus (Abb. 6b).

Dies wirft die Frage nach der physiologischen Funktion der Gene auf, die mit der \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Assimilation in methanogenen Archaeen zusammenhängen. Basierend auf unseren Daten könnte es sein, dass andere Methanogene diese Enzyme immer noch benötigen, um Schwefel über den Weg 1c aufzunehmen (Extended Data Abb. 1). Die Schwefelgruppe würde durch eine nichtkanonische Sulfotransferase auf einen Akzeptor übertragen, was für unbekannte Biosynthesewege wichtig sein könnte. Dies könnte erklären, warum das Gen, das für das PAPP kodiert, immer noch in Methanogenen vorhanden ist, die auch die Gene enthalten, die sowohl für ein ATPS als auch für ein APSK kodieren. Ein Gegenargument zu dieser Hypothese ist das Vorhandensein des Thioredoxin-abhängigen PAPSR oder APSR, das in M. jannaschii charakterisiert ist, was eher für Route 1b spricht (Ref. 13, 44, 45). Es ist erwähnenswert, dass das Gen, das für dieses mutmaßliche assimilatorische APSR kodiert, auch in M. thermolithotrophicus (WP_018154242.1) existiert. Daher sind weitere biochemische Untersuchungen erforderlich, um die physiologische Rolle dieser Enzyme in Methanogenen aufzuklären.

Diese Arbeit enthüllte den einzigartigen \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Assimilationsstoffwechsel eines methanogenen Archäons und bot eine molekulare Momentaufnahme des gesamten Satzes an Enzymen, die an diesem Stoffwechselweg beteiligt sind. M. thermolithotrophicus aktiviert \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) durch herkömmliches ATPS und APSK, wandelt es jedoch durch unkanonische Enzyme weiter um (Abb. 5c).

Vom APSK produziertes PAPS wird normalerweise durch Thioredoxin- oder Glutathion-abhängige assimilatorische PAPS-Reduktasen metabolisiert, die als Homo-Oligomere organisiert sind. Im Gegensatz dazu erbte MtPAPSR die heterotetramere Organisation und den FAD-basierten katalytischen Mechanismus von dissimilatorischen APS-Reduktasen (Abb. 4 und Extended Data Abb. 1 und 9). Wir schlagen vor, dass die Substitution nur einiger weniger Aminosäuren die Spezifität in Richtung PAPS verlagerte (Abb. 4d–f), was möglicherweise das Ergebnis einer fein abgestimmten evolutionären Anpassung zur Förderung der Assimilation \({{\rm{SO}} }_{4}^{2-}\) Reduktion. Es wäre lohnenswert, die Reste, die PAPSR-Merkmale im aktiven Zentrum verleihen (Ser122, Lys120, Arg121), mit denen von APSR auszutauschen und die Auswirkungen auf die Substrataffinität zu beobachten.

Das erzeugte PAP wird durch MtPAPP effizient hydrolysiert. Diese PAP-Phosphatase gehört zur DHH-Familie der Phosphoesterasen und weist strukturelle Homologie mit Exonukleasen auf, weist jedoch keine Sequenzhomologie mit diesen auf. Im Vergleich dazu haben herkömmliche PAP-Phosphatasen (Teil der FIG-Superfamilie) eine andere Faltung (d. h. CysQ) und verwenden drei Magnesiumionen, um das 3′-Phosphat von PAP30 zu hydrolysieren. MtPAPP scheint ein bemerkenswertes Beispiel für konvergente Evolution zu sein und veranschaulicht, wie Archaeen ihren eigenen Apparat zur effizienten Entgiftung von PAP entwickelten.

Fsr der Gruppe I katalysiert den letzten Schritt des \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktionswegs. Dieses Enzym weist deutliche Merkmale dissimilatorischer Sulfitreduktasen auf, wobei die Zusammensetzung des aktiven Zentrums assimilatorisch ist23. Durch die Kodierung des fsr-Gens an einem anderen Ort und höchstwahrscheinlich unter einem anderen Regulator für seine Expression (z. B. Sulfitsensor) ist das Methanogen in der Lage, schnelles \({{\rm{SO}}}_{3}^ abzukoppeln {2-}\) Entgiftung durch den Ausdruck der gesamten \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) Assimilationsmaschinerie. Während MtATPS, MtAPSK und MtPAPSR eher langsame Katalyseraten aufweisen (siehe ergänzende Diskussion), weisen MtFsr und MtPAPP im Vergleich zu den ersten Schritten hohe spezifische Aktivitäten auf, was das Gleichgewicht in Richtung HS−-Produktion auslöst und toxische Zwischenprodukte effizient eliminiert. Obwohl unser vorgeschlagener Weg (Abb. 5c) eine günstige Thermodynamik ermöglichen würde, sollten die ersten Reaktionen reguliert werden, um unnötige ATP-Hydrolyse zu vermeiden. Wir vermuten, dass MtATPS, MtAPSK und MtPAPSR durch die Akkumulation ihrer eigenen Produkte kreuzreguliert werden, wie bereits für Homologe gezeigt39,46,47, was eine direkte Retrokontrolle zur Harmonisierung des intrazellulären Schwefelflusses ermöglichen würde.

M. thermolithotrophicus lebt an der thermodynamischen Grenze des Lebens, aber die beschriebene \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Assimilation erfordert die Hydrolyse von drei ATP zu ADP für ein verarbeitetes \({ {\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Dennoch wird erwartet, dass unter natürlichen Bedingungen der Vorteil der Fixierung von \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) den Energieaufwand ausgleicht. Die \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-gezüchteten Kulturen werden durch den zusätzlichen Energiebedarf nicht beeinträchtigt, was durch unsere Kultivierungsbedingungen erklärt werden kann, die für einen hohen und konstanten H2 sorgen Partialdruck. Unter Umweltbedingungen mit einem niedrigeren und schwankenden H2-Partialdruck dürfte das Wachstum auf \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) für M. thermolithotrophicus eine größere Herausforderung darstellen. Während das Methanogen die ATP-Investition nicht umgehen kann, hat es möglicherweise eine energiesparende Strategie für die 8-Elektronen-Reduktionsreaktion von PAPS zu HS− gefunden. Fsr oxidiert F420H2, das durch die F420-reduzierende Hydrogenase23,48 zurückreduziert wird. F420H2 oder NAD(P)H wären vorteilhafte Elektronendonoren für MtPAPSR, aber es würde die Unterstützung eines Oxidasepartners erfordern, der noch nicht identifiziert wurde. Alternativ kann das eigenständige MtPAPSR von reduziertem Ferredoxin abhängen, das aus der H2-abhängigen Ferredoxinreduktion über den Eha/Ehb-Komplex erhalten werden könnte, einer weiteren vorteilhaften Strategie von Hydrogenotrophen, um Reduktionskraft zur Förderung anaboler Reaktionen bereitzustellen (vorgeschlagen in Abb. 5c) ( Ref. 49).

Bisher scheint es, dass der damit einhergehende Prozess der Methanogenese und der vollständigen \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion zu HS− auf M. thermolithotrophicus beschränkt ist. Bemerkenswerterweise besteht der einzige offensichtliche Unterschied zwischen M. thermolithotrophicus und anderen Methanogenen mit dem genomischen Potenzial zur Durchführung einer \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion im Erwerb einer PAPS-Reduktase, die zur dissimilatorischen Familie zu gehören scheint (ergänzende Abbildung 8, erweiterte Daten, Abbildung 7b und ergänzende Diskussion). Die physiologische Funktion dieser \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktions-assoziierten Gene in anderen Methanogenen sowie die Vorteile der Assimilation von \({ {\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) für M. thermolithotrophicus. Aus ökologischer Sicht könnte es für das Überleben von M. thermolithotrophicus vorteilhaft, wenn nicht sogar wesentlich sein, von der H2S-Aufnahme auf \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-} umstellen zu können. \) Reduzierung unter Umweltbedingungen (siehe ergänzende Diskussion).

Die Transplantation des M. thermolithotrophicus \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktionssystems in methanogene Wirte, die bereits als Gaskonverter verwendet werden (z. B. Methanothermobacter), würde Umgehen Sie den Bedarf an hochgiftigem und explosivem H2S, indem Sie kostengünstiges und reichlich vorhandenes \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\" verwenden. Ein \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-reduzierendes hydrotrophes Methanogen eröffnet nicht nur fantastische Möglichkeiten für sicherere biotechnologische Anwendungen, sondern wirft auch die Frage nach dem Ausmaß einer Verflechtung von Methanogenese und Sulfatreduktion auf Weg während der Evolution der frühen Archaeen. M. thermolithotrophicus hat höchstwahrscheinlich den gesamten \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktionspfad schrittweise über ein „Mix-and-Match“-Szenario zusammengestellt, was einen Wettbewerbsvorteil darstellt schwankende Schwefelquellenbedingungen und die Erweiterung seiner ökologischen Nischen.

M. thermolithotrophicus (DSM 2095), M. infernus (DSM 11812) und A. fulgidus (DSM 4304) Zellen wurden vom Leibniz-Institut DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland) bezogen. M. thermolithotrophicus und M. infernus wurden in demselben zuvor beschriebenen Minimalmedium mit einigen Modifikationen kultiviert23 (die vollständige Zusammensetzung des Mediums finden Sie unter Erweiterte Daten).

Das Zellwachstum wurde spektrophotometrisch durch Messung der OD600 verfolgt. Die Reinheit der Kultur wurde lichtmikroskopisch überprüft. Die Methanogene wurden mit 1 × 105 Pa H2:CO2 im Verhältnis 80:20 in der Gasphase kultiviert. M. infernus wurde bei 75 °C in 250-ml-Glasserumflaschen kultiviert und M. thermolithotrophicus wurde bei 65 °C in Flaschen oder Fermentern gezüchtet. Die Serumflaschen wurden nicht geschüttelt, sondern standen. A. fulgidus wurde in anaeroben und versiegelten 22-ml-Hungate-Röhrchen mit 0,8 × 105 Pa N2:CO2 kultiviert. Die DSM 4304-Kultur (0,5 ml) wurde in 10 ml klassischem Medium (siehe ergänzende Materialien für die vollständige Zusammensetzung der Medienzusammensetzung) mit einer Endkonzentration von 20 mM d/l-Lactat gezüchtet. Die Kultur wurde stehend bei 80 °C inkubiert. Alle Kulturen wurden bei Raumtemperatur im Dunkeln unter anaeroben Bedingungen gelagert. Für das A. fulgidus-Medium stellten wir fest, dass hohe Molybdatkonzentrationen es instabil machten. Eine der Flaschen mit einer hohen MoO42−-Konzentration verfärbte sich gelb (ohne Zusammenhang mit der O2-Kontamination) und wurde weggelassen, was zu dreifachen statt vierfachen Kulturen führte (Abb. 1c, rechtes Feld).

Auf 2 mM Na2S gezüchtete M. thermolithotrophicus-Zellen wurden nacheinander in 10 ml schwefelfreies Kultivierungsmedium überführt. Nach zwei Transfers unterstützte die übertragene Schwefelkonzentration des Inokulums das Wachstum von M. thermolithotrophicus nicht. Durch die Zugabe von 2 mM Na2SO4 wurde das Wachstum von M. thermolithotrophicus wieder aufgenommen. Um das Fehlen von HS− auszugleichen, wurde kein Reduktionsmittel zugesetzt, wodurch normalerweise eine geeignete reduzierende Umgebung geschaffen wird. Besonders wichtig für die Reproduzierbarkeit ist die Inkubation ohne Schütteln. Daher wurden die Kulturen nach der Inokulation bei 65 °C inkubiert, eine Nacht lang stehen gelassen und anschließend bei 180 Umdrehungen pro Minute (U/min) geschüttelt, bis sie ihren maximalen OD600 erreichten. Die Gasphase wurde nach der Inkubation über Nacht aufgefrischt, um den Druck bei 1 × 105 Pa H2:CO2 zu halten. Um die minimale \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Konzentration zu messen, die zur Aufrechterhaltung des Wachstums erforderlich ist, wurden schwefellimitierte M. thermolithotrophicus-Zellen (unter Verwendung eines Inokulum-zu-Medium-Verhältnisses von 1:20) verwendet ) wurden mit 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM, 0,1 mM und 0,04 mM Na2SO4 versehen. Bei Zellen, die mit 0,1 mM gewachsen waren, war immer noch Wachstum zu beobachten, jedoch nicht mit 0,04 mM Na2SO4.

Zur Messung der \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Konzentrationen wurde Ionenchromatographie (Methrom-Ionenchromatograph) verwendet, die über die Software IC MagIC Net 3.2 analysiert wurde. Pro Probe war ein Volumen von 8 ml erforderlich, mit einer maximalen Konzentration von 0,5 mM \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-reduzierende M. thermolithotrophicus-Zellen wurden daher in 1-l-Duran-Flaschen mit 100 ml schwefelfreiem Medium, das mit 0,5 mM ergänzt wurde, gezüchtet \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) vor der Inokulation. Als Negativkontrolle wurden mit 0,5 mM Na2S gezüchtete M. thermolithotrophicus-Zellen verwendet, inokuliert und ähnlich wie die \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-reduzierenden Kulturen gesammelt. Alle Proben wurden aerob entnommen und durch einen 0,45 µM-Filter (Sartorius) geleitet. Wenn die Zelldichten zu hoch waren, um gefiltert zu werden, wurden die Proben 7 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 × g zentrifugiert und der Überstand für ionenchromatographische Messungen entnommen. Sofern die Messungen nicht sofort durchgeführt wurden, wurden die Proben bei 4 °C gelagert.

M. thermolithotrophicus wurde in drei unabhängigen Fermentern bei 60 °C mit 10 mM Na2SO4 als einziger Schwefelquelle gezüchtet. Für jeden Fermenter wurden 7 l anaerobes Kultivierungsmedium (siehe Schwefelfreies Kultivierungsmedium für Methanokokken), ergänzt mit 10 mM Na2SO4, kontinuierlich mit H2:CO2 (80:20, 3 l min−1) durchgeblasen. Unter Rühren (220 U/min) wurde das Medium mit 360 ml Vorkultur (mit einer OD600 größer als 3) beimpft. Eine Stunde nach der Inokulation wurde die Kultur bei 800 U/min gerührt. NaOH (1 M) wurde als Base verwendet, um den pH-Wert nach der Ansäuerung neu einzustellen, was mit einer pH-Sonde kontrolliert wurde. Die Zellen wurden bis zur späten exponentiellen Phase (OD600 von 6,25–6,8) gezüchtet und dann sofort in ein anaerobes Zelt (N2:CO2-Atmosphäre im Verhältnis 90:10) überführt. Die Zellen wurden durch 30-minütige anaerobe Zentrifugation bei 6.000 × g und 4 ° C gesammelt. Die höchste OD600nm, die für M. thermolithotrophicus in einem mit SO42 angebauten Fermenter gemessen wurde, betrug 6,8 nach 20 Stunden. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) Kultur (7 l) mit einer OD600 von 6,8 ergab 54 g Zellen (Feuchtgewicht). Das Zellpellet wurde in eine verschlossene Flasche überführt, mit 0,3 × 105 Pa N2 begast, in flüssigem N2 schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

Die DNA-Sequenzen der ATP-Sulfurylase, der APS-Kinase, der PAP-Phosphatase und der PAPS-Reduktase α- und β-Untereinheiten von M. thermolithotrophicus wurden für E. coli codonoptimiert, synthetisiert und in pET-28a(+)-Vektoren kloniert. Für MtATPS, MtAPSK und MtPAPP wurden die Restriktionsschnittstellen NdeI und BamHI verwendet, wobei vor BamHI ein Stoppcodon (TGA) eingebaut wurde. Für MtPAPSR wurde ein His-Tag am C-Terminus der α-Untereinheit platziert und eine Ribosomenbindungsstelle zwischen den kodierenden Sequenzen der α- und β-Untereinheiten eingefügt. Das MtPAPSR-Konstrukt hatte die Restriktionsstellen NcoI und BamHI, wobei ein Stoppcodon nach dem His-Tag für die α-Untereinheit und ein Stoppcodon vor BamHI für die β-Untereinheit eingebaut war. Diese Schritte wurden von GenScript (GenScript) durchgeführt. Alle verwendeten Sequenzen sind in den Zusatzinformationen unter Konstrukte und Gen-Codon-Optimierung detailliert beschrieben.

Alle Konstrukte wurden unter aeroben Bedingungen nach einem ähnlichen Protokoll überexprimiert und gereinigt, mit Ausnahme von MtPAPSR, das unter anaerober Atmosphäre überexprimiert und gereinigt wurde. Alle Enzyme wurden auf eine HisTrap-Hochleistungssäule (GE Healthcare) geleitet, gefolgt von, falls erforderlich, Tag-Spaltung und Gelfiltration (das vollständige Protokoll finden Sie unter „Ergänzende Materialien“).

Gereinigtes MtATPS, MtAPSK und MtPAPP wurden in 25 mM Tris/HCl pH 7,6, 10 % v/v Glycerin, 2 mM Dithiothreitol und 150 mM NaCl aufbewahrt. MtPAPSR wurde im gleichen Puffer ohne NaCl aufbewahrt. Frisch zubereitete, ungefrorene Proben wurden sofort zur Kristallisation verwendet. MtATPS-, MtAPSK- und MtPAPP-Kristalle wurden unter aeroben Bedingungen bei 18 °C erhalten. MtPAPSR-Kristalle wurden anaerob (N2:H2, Gasverhältnis 97:3) durch anfängliches Screening bei 20 °C erhalten. Die sitzende Tropfenmethode wurde auf 96-Well-MRC-2-Tropfen-Kristallisationsplatten aus Polystyrol (SWISSCI) durchgeführt, die 90 µl Kristallisationslösung im Reservoir enthielten.

MtATPS (0,7 µl) in einer Konzentration von 14 mg ml−1 (MtATPS Form 1, Extended Data Table 1) oder in einer Konzentration von 27 mg ml−1 (MtATPS Form 2) wurde mit 0,7 µl Reservoirlösung gemischt. MtATPS mit 27 mg ml−1 wurde mit 2 mM AMPcPP sowie 2 mM Na2SO4 cokristallisiert. Für MtATPS Form 1 erschienen nach einigen Wochen transparente sternförmige Kristalle unter den folgenden Kristallisationsbedingungen: 35 % w/v Pentaerythritolethoxylat (15/4 EO/OH) und 100 mM 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES). ) pH-Wert 6,5. Für MtATPS Form 2 erschienen nach einigen Wochen transparente, lange, aber dünne plattenförmige Kristalle unter den folgenden Kristallisationsbedingungen: 20 % w/v Polyethylenglykol 8000, 100 mM MES pH 6,0 und 200 mM Calciumacetat.

MtAPSK (0,7 µl) in einer Konzentration von 17,6 mg ml−1 wurde mit 0,7 µl Reservoirlösung gemischt und mit 2 mM MgCl2 cokristallisiert. Transparente, plattenförmige Kristalle erschienen nach einigen Wochen unter den folgenden Kristallisationsbedingungen: 20 % w/v Polyethylenglykol 3350 und 100 mM Trinatriumcitrat pH 5,5. MtAPSK wurde auch mit 2 mM MgCl2 und 2 mM APS kristallisiert, aber die erhaltenen Strukturen dieser Kristalle waren von geringerer Auflösung und ohne jegliches Substrat oder Produkt im aktiven Zentrum.

MtPAPSR (0,7 µl) in einer Konzentration von 20 mg ml−1 wurde mit 0,7 µl Reservoirlösung gemischt und mit FAD (0,5 mM Endkonzentration) cokristallisiert. Der für die Phaseneinstellung verwendete Kristall war ein braunes, flaches Quadrat und erschien nach einigen Tagen in den folgenden Kristallisationsbedingungen: 40 % v/v 2-Methyl-2,4-pentandiol und 100 mM Tris/HCl pH 8,0.

Der zur Verfeinerung mit hoher Auflösung verwendete Kristall war braun und hatte die Form einer länglichen Platte. Es erschien nach einigen Tagen unter den folgenden Kristallisationsbedingungen: 35 % v/v 2-Methyl-2,4-pentandiol, 100 mM Tris pH 7,0 und 200 mM NaCl. Vor der Übertragung auf flüssiges N2 wurde der Kristall 7 Minuten lang in 10 mM Dinatrium-3'-phosphoadenosin-5'-phosphat eingeweicht.

MtPAPP (0,7 µl) in einer Konzentration von 20 mg ml−1 wurde mit 0,7 µl Reservoirlösung gemischt und mit Tb-Xo4 (10 mM Endkonzentration), MnCl2 (2 mM Endkonzentration) und 2 mM PAP cokristallisiert. Das Tb-Xo4 ist ein Keimbildner/Phasenbildner50, der die Kristallisationsleistung erhöhen sollte; In diesem Fall wurde jedoch die gleiche kristalline Form in Abwesenheit der Verbindung erhalten und mit ähnlicher Auflösung gebeugt. Transparente bipyramidale Kristalle erschienen nach einigen Wochen unter den folgenden Kristallisationsbedingungen: 1,6 M Trinatriumcitrat.

Die Handhabung der MtPAPSR-Kristalle erfolgte im Coy-Zelt unter anaerober Atmosphäre (N2:H2, 97:3); Die anderen Kristalle wurden unter aeroben Bedingungen gehandhabt. Die Kristalle wurden direkt in flüssigen Stickstoff getaucht oder 5–30 Sekunden lang in ihrer mit einem Kryoschutzmittel ergänzten Kristallisationslösung eingeweicht, bevor sie in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Für MtATPS Form 2 wurde 30 % Glycerin als Kryoprotektivum verwendet. Für MtAPSK wurde 25 % Ethylenglykol als Kryoschutzmittel verwendet.

Kristalle wurden bei 100 K an verschiedenen Synchrotrons getestet und gesammelt (erweiterte Datentabelle 1). Die Daten wurden mit autoPROC51 verarbeitet, mit Ausnahme von MtPAPP, das mit der Indexierung durch die X-ray Detector Software (XDS) und dem mit SCALA52 durchgeführten Skalierungsschritt bessere Statistiken lieferte. Alle Datenerfassungsstatistiken werden in der erweiterten Datentabelle 1 bereitgestellt. MtATPS-Formulare 1 und 2, MtAPSK und MtPAPP wurden mithilfe von PHENIX mit den folgenden Vorlagen gelöst: 1V47 (ATPS von T. thermophilus) für MtATPS-Formular 1, MtATPS-Formular 1 für MtATPS-Formular 2 und 5CB6 (APS-Kinase aus Synechocystis sp.) für MtAPSK. Für MtPAPP wurde die Vorlage de novo mit AlphaFold 2 erstellt (Ref. 32).

Für MtPAPSR wurde ein Röntgenfluoreszenzspektrum an der Fe-K-Kante gemessen, um die Datenerfassung bei der entsprechenden Wellenlänge zu optimieren. Für das Einzelwellenlängen-Experiment zur anomalen Dispersion wurden Datensätze bei 1,73646 Å gesammelt. Native Datensätze wurden bei einer Wellenlänge von 0,97625 Å auf einem anderen Kristall gesammelt. Die Daten wurden mit autoPROC51 verarbeitet und skaliert. Phaseneinstellung, Dichteänderung und automatischer Aufbau wurden mit CRANK-2 (Ref. 53) durchgeführt.

Alle Modelle wurden manuell mit COOT umgebaut und mit PHENIX54,55 weiter verfeinert. Bei der Verfeinerung wurden nichtkristallographische Symmetrie und eine Translationslibrationsschraube angewendet. Bei allen Strukturen außer ATPS Form 1 wurden im letzten Verfeinerungszyklus Wasserstoffe in Fahrposition hinzugefügt. Wasserstoff wurde in den endgültigen abgeschiedenen Modellen entfernt.

Alle Modelle wurden mit MolProbity56 validiert. Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung sowie PDB-Identifikationscodes für die hinterlegten Modelle und Strukturfaktoren sind in der erweiterten Datentabelle 1 aufgeführt. Die Zahlen wurden mit PyMOL (Schrödinger) generiert. Das Metall in MtATPS wurde mit CheckMyMetal57 als Zink modelliert.

Um die Expressionsniveaus von MtFsr zu visualisieren, wenn Zellen auf verschiedenen Schwefelquellen gezüchtet wurden, wurde eine hrCN-PAGE durchgeführt. M. thermolithotrophicus-Kulturen (2 × 10 ml) wurden entweder mit 2 mM Na2S, 2 mM Na2SO3, 2 mM Na2S und 2 mM Na2SO4 oder 2 mM Na2SO4 als Schwefelsubstrate ergänzt und eine Nacht lang bei 65 °C stehen gelassen. Die Zellen wurden durch anaerobe Zentrifugation bei 6.000 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur gesammelt und die Zellpellets wurden in 2 ml Lysepuffer (50 mM Tricin, pH 8, 0 und 2 mM Natriumdithionit) resuspendiert. Die Zellen wurden 10 s lang 4x mit 70 % Intensität beschallt, gefolgt von einer 30 s langen Pause (MS 73-Sonde, SONOPULS Bandelin). Die hrCN-PAGE wurde anaerob durchgeführt und das Protokoll ist in den erweiterten Daten unter „Vorbereitung der hrCN-PAGE“ detailliert beschrieben. Es wurde ein Gel mit einem Acrylamid-Gradienten von 8–15 % durchgeführt (siehe Abb. 5b) und ein weiteres mit einem Acrylamid-Gradienten von 5–15 % (siehe Quelldaten, Abb. 5).

Die Aktivität beider Enzyme wurde durch die Produktion von ADP bestimmt, das über Pyruvatkinase und Laktatdehydrogenase an die NADH-Oxidation gekoppelt war58. Die Tests wurden in einem Endvolumen von 100 µl 96-Well-Deep-Well-Platten durchgeführt und spektrophotometrisch überwacht (Omega-Multimode-Mikroplatten-Reader) bei 360 nm und 35 °C. Als Puffer wurde KH2PO4 (100 mM) bei pH 7,0, ergänzt mit 1,5 mM MgCl2 und 100 mM KCl, verwendet. Für NADH wurde für die oben genannten Bedingungen experimentell ein molarer Extinktionskoeffizient von 4.546,7 cm−1 M−1 ermittelt. Zum Puffer 1 mM NADH, 2,5 mM Na2SO4, 1 mM Phosphoenolpyruvat (PEP), 2 mM ATP, 2 U anorganische Pyrophosphatase (Saccharomyces cerevisiae, 10108987001, Sigma-Aldrich), 1,1 U ml−1 Lactatdehydrogenase, 0,8 U ml− 1 Pyruvatkinase (Kaninchenmuskel, P0294, Sigma-Aldrich) und 0,5 mg ml−1 MtAPSK (alle Endkonzentrationen) wurden hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5 mg ml−1 MtATPS gestartet. Die Zugabe von 0,02 mM Na2MoO4 hatte keinen Einfluss auf die Aktivität (0,116 ± 0,027 µmol oxidiertes NADH min−1 mg−1), aber die Zugabe von 2 mM Na2MoO4 führte zu einer Abnahme (0,068 ± 0,019 µmol oxidiertes NADH min−1 mg−1). ). Alle Tests wurden dreifach durchgeführt.

Die Aktivität des MtPAPP wurde durch die Produktion von Orthophosphat bestimmt, das mit dem Malachitgrünphosphat-Assay-Kit (Sigma-Aldrich) durch die Bildung eines grünen Komplexes quantifiziert wurde. Die Tests wurden in Deep-Well-Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt und die Absorption bei 620 nm wurde spektrophotometrisch verfolgt (Omega Multimode-Mikroplattenlesegerät). Als Puffer wurde Tris/HCl (25 mM) bei pH 7,64 verwendet. Puffer, 40 µM PAP oder 90 µM AMP/ADP/ATP/APS oder PPi, 1 mg ml−1 Rinderserumalbumin, 50 µM MnCl2 und/oder 50 µM MgCl2 (Endkonzentration) wurden in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gemischt Eis. Zuvor gefrorenes MtPAPP (Endkonzentration 0,5 µg ml−1) wurde zugegeben und die Mischung (Endvolumen 40 µl) sofort 5 Minuten lang bei 40 °C inkubiert. Als nächstes wurden 14 µl des Reaktionsgemisches in 66 µl gefiltertem Milli-Q H2O verdünnt und sofort in flüssigem N2 schockgefroren, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend wurden den Proben 20 µl Malachitgrün-Reagenz zugesetzt, die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Bildung des Grünkomplexes bei 620 nm gemessen. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt. Die in Abb. 3a dargestellten Messungen stammen aus zwei verschiedenen Experimenten (linkes und rechtes Unterpanel). Beide Experimente wurden an zwei verschiedenen Tagen mit demselben Enzympräparat durchgeführt.

Da PAPS bei hohen Temperaturen instabil ist, haben wir zunächst versucht, die Aktivität von MtPAPSR in Richtung der PAPS-Produktion zu bestimmen, wie zuvor für dissimilatorische APS-Reduktasen für die APS-Produktion beschrieben38. Die PAPS-Oxidation wurde in 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) bestimmt, der 5 mM Na2SO3, 2 mM PAP oder 2 mM AMP (Endkonzentrationen) und 3,27 µg ml−1 MtPAPSR enthielt. Die Reaktion wurde mit einer Endkonzentration von 0,5 mM K3Fe(CN)6 gestartet. Die Abnahme der Absorption bei 420 nm wurde gemessen und um die Hintergrundreaktion ohne Enzym korrigiert. Es wurde keine Aktivität festgestellt. Daher verwendeten wir die physiologische Reaktion, um die MtPAPSR-Aktivität zu überwachen. Um den gekoppelten MtPAPSR-Assay durchzuführen, mussten die Enzyme gleichzeitig gereinigt und sofort für den Assay verwendet werden (siehe ergänzende Materialien für das detaillierte Reinigungsprotokoll für die in diesem Assay verwendeten Enzyme).

MtPAPSR-Aktivitätstests wurden in einer anaeroben Atmosphäre (100 % N2) bei 45 °C durchgeführt. Die Tests wurden in einem Endvolumen von 200 µl in 96-Well-Deep-Well-Platten durchgeführt und spektrophotometrisch auf einem SPECTROstar Nano-Mikroplattenlesegerät überwacht. Als Puffer wurde HEPES (50 mM, pH 7,0), ergänzt mit 50 mM KCl, 1,5 mM MnCl2 und 1,5 mM MgCl2, verwendet. Reduziertes Methylviologen (MVred, 0,5 mM) diente als Elektronendonor für MtPAPSR. Der molare Extinktionskoeffizient (ε600nm = 8.133,3 cm−1 M−1) wurde experimentell unter den oben genannten Bedingungen und durch Reduktion von Methylviologen mit 2 mM Natriumdithionit bestimmt. Für den Test wurde Methylviologen mit Kohlenmonoxid durch die CO-Dehydrogenase aus Clostridium autoethanogenum gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll reduziert59. CO wurde gegen N2 ausgetauscht und das MVred wurde sofort für den Test verwendet. Zum Puffer und MVred, 5 mM ATP, 1 mM Natriumdithionit, 0,2 U Pyrophosphatase (E. coli, MFCD00131379, Sigma-Aldrich), 0,127 mg ml–1 MtATPS, 0,12 mg ml–1 MtAPSK, 0,1 mg ml–1 MtPAPP und 0,0645 mg ml−1 MtPAPSR wurden hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 5 mM Na2SO4 gestartet und anschließend erfolgte die Oxidation von MVred bei 600 nm. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt.

Um die Sulfitreduktaseaktivität aus M. thermolithotrophicus zu bestimmen, wurden Kulturen entweder auf 2 mM Na2S, 2 mM Na2SO3 oder Na2SO4 in 10 ml des oben genannten Mediums in Serumflaschen gezüchtet. Zellen (9 ml) wurden in der späten exponentiellen Phase (OD600: 3,45 für 2 mM Na2S, 3,91 für 2 mM Na2SO3, 3,37 für Na2SO4) durch 10-minütige Zentrifugation bei 6.000 × g und 4 °C gesammelt. Der Überstand wurde verworfen und die Zellpellets in flüssigem N2 eingefroren. Die Pellets wurden dann in 1 ml 0,5 M KH2PO4 pH 7,0 resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung (2 × 10 s bei 50 % Intensität, Sonde MS73, SONOPULS Bandelin) lysiert, gefolgt von Zentrifugation bei 4 °C und 15.600 × g. Der Überstand wurde durch einen 0,2-µm-Filter geleitet und die Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode bestimmt (6,63 mg ml−1 für 2 mM Na2S, 6,14 mg ml−1 für 2 mM Na2SO3 und 6,31 mg ml−1 für Na2SO4). Die Aktivitätstests wurden unter anaerober Atmosphäre (100 % N2) bei 50 °C in 96-Well-Deep-Well-Platten durchgeführt und spektrophotometrisch überwacht (SPECTROstar Nano Mikroplatten-Lesegerät). Die Testmischung enthielt 0,5 M KH2PO4 pH 7,0, 118 µM MVred (Endkonzentration, zuvor mit der äquimolaren Menge Natriumdithionit reduziert) und 30 µM Na2SO3 (Endkonzentration). Unter diesen Bedingungen wurde experimentell ein molarer Extinktionskoeffizient von ε600nm = 9.840 cm−1 M−1 ermittelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 0,05 µg Zellextrakt gestartet, gefolgt von der Oxidation von MVred bei 600 nm. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt.

Eine detaillierte Beschreibung der phylogenetischen Analyse finden Sie unter Ergänzende Materialien60.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle für den Strukturvergleich verwendeten Strukturen sind in der Proteindatenbank zugänglich und werden entsprechend im Text zitiert. Die Strukturen wurden in der Proteindatenbank unter der ID: 8A8G für MtATPS Form 1, 8A8D für MtATPS Form 2, 8A8H für MtAPSK, 8A8K für MtPAPP und 8A8O für MtPAPSR hinterlegt. Die Daten für diese Studie sind im Papier und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken dem Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie und der Max-Planck-Gesellschaft für die kontinuierliche Unterstützung; das SOLEIL-Synchrotron für die Strahlzeitzuweisung und das Strahllinienpersonal von Proxima-1 für Unterstützung bei der Datenerfassung; das Personal der Strahlführung X06DA von SLS und P11 bei PETRA III; DR Dean für die Bereitstellung des RE-Plasmids pDB1281; C. Probian und R. Appel für die kontinuierliche Unterstützung im Labor für Mikrobiellen Stoffwechsel und bei der Kultivierung von Archaeoglobus fulgidus; G. Wegener und M. Alisch von der HGF MPG Joint Research Group for Deep-Sea Ecology and Technology für Unterstützung bei den Ionenchromatographie-Messungen; U. Ermler, J. Fritz-Steuber und G. Fritz für tolle Diskussionen und kritische Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und der Stiftung Novo Nordisk finanziert (NNF21OC0070790, TW). MJ wurde durch das Schwerpunktprogramm 1927 der Deutschen Forschungsgemeinschaft „Eisen-Schwefel für das Leben“ (WA 4053/1-1, MJ) gefördert.

Open-Access-Förderung durch die Max-Planck-Gesellschaft.

Gruppe Mikrobieller Stoffwechsel, Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, Bremen, Deutschland

Marion Jespersen & Tristan Wagner

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MJ kultivierte die Methanogene, reinigte und kristallisierte alle in dieser Studie beschriebenen Proteine. MJ führte die gesamte biochemische Charakterisierung durch. MJ und TW sammelten Röntgendaten und lösten die Strukturen. MJ und TW haben alle Modelle verfeinert und validiert. TW und MJ haben die Forschung entworfen und die Arbeit geschrieben.

Korrespondenz mit Tristan Wagner.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt M. Elizabeth Stroupe und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Assimilatorische \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion. (Route 1a, 1b, 1c) \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) wird durch die ATP-Sulfurylase (zum Beispiel Glycine max, PDB: 4MAF) zu APS aktiviert. (1a) APS wird durch einen einen [4Fe-4S]-Cluster enthaltenden APS-Reduktase direkt zu Sulfit (\({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\)) und AMP reduziert ( zum Beispiel Pseudomonas aeruginosa, PDB: 2GOY, Thioredoxin-abhängig). (1b, c) Alternativ wird das APS durch eine APS-Kinase (zum Beispiel Arabidopsis thaliana, PDB: 3UIE) weiter phosphoryliert, um PAPS zu produzieren. (1b) Eine PAPS-Reduktase (Saccharomyces cerevisiae, PDB: 2OQ2, Thioredoxin-abhängig) wandelt PAPS in \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) und PAP um. Das PAP wird durch eine PAP-Phosphatase (zum Beispiel Mycobacterium tuberculosis, PDB: 5DJJ) zu anorganischem Phosphat (Pi) und AMP hydrolysiert. (1a, b) Eine Sulfitreduktase (Escherichia coli, PDB: 1AOP) reduziert das \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) zu S2−, das dann eingebaut werden kann in Biomasse. Im Weg 1c katalysiert eine Sulfotransferase (z. B. A. thaliana, PDB: 5MEK) die Übertragung der Sulfogruppe (R-OSO3−) von PAPS auf einen Alkohol- oder Aminakzeptor. Dissimilatorische \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) wird durch das ATPS zu APS aktiviert und weiter reduziert auf \({{\rm{SO}}}_{3}^{ 2-}\) durch eine APS-Reduktase (zum Beispiel Archaeoglobus fulgidus, PDB: 2FJA), die zwei [4Fe-4S]-Cluster und ein FAD enthält. Eine Sulfitreduktase (zum Beispiel A. fulgidus, PDB: 3MM5) reduziert das \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) und verzweigt es auf dem Träger DsrC. Der Membrankomplex DsrMKJOP (zum Beispiel Allochromatium vinosum) reduziert den Schwefel zu HS− unter gleichzeitiger Ionentranslokation zur Energieeinsparung. Siroheme, FAD und [4Fe-4S]-Cluster werden in Stäbchen und Kugeln dargestellt, wobei Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Eisen in Rosa, Rot, Blau, Gelb und Orange gefärbt sind. Die Enzyme werden im Cartoon und auf der transparenten Oberfläche in ihrem oligomeren Zustand dargestellt. Das ATPS von A. fulgidus wurde mit Alphafold232 modelliert und grün eingefärbt. Die bifunktionale ATP-Sulfurylase CysDN unter Verwendung eines zusätzlichen GTP wurde hier zur Vereinfachung des Schemas nicht vorgestellt.

a, \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) Toleranz von M. thermolithotrophicus. Das Archaeon wurde auf \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (graues Quadrat), \({{\rm{SO}}}_{4}^{2 -}\), ergänzt mit einer äquimolaren Menge an \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (Weizenquadrat) und \({{\rm{SO}}}_{ 4}^{2-}\), ergänzt mit einem Überschuss an \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (dunkelrotes Quadrat). Als Kontrolle wurden Na2S-Kulturen (S2-, schwarzes Dreieck) und Na2S-Kulturen mit einem Überschuss an \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (rotes Dreieck) verwendet . Dieses Wachstumsexperiment wurde in zweifacher Ausfertigung durchgeführt. b, Wirkung der Verhältnisse \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). in M. thermolithotrophicus-Kulturen, die auf 0,5 mM Na2SO4 gezüchtet wurden. Graue Quadrate zeigen die Wachstumskurve von \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduzierern ohne Zusatz von \({{\rm{MoO}}}_{4}^ {2-}\). Die roten Quadrate zeigen die Wachstumskurve von \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktionsmitteln, die 5 mM \({{\rm{MoO}}}_{4 ausgesetzt sind }^{2-}\), gefolgt von der Zugabe von 25 mM Na2SO4. Schwarze, gestrichelte Pfeile zeigen die Zeit von \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) und \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-} \) Ergänzung. Dieses Wachstumsexperiment wurde dreifach durchgeführt. c, Empfindlichkeit von Archaeoglobus fulgidus gegenüber \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\). Hier ein \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) Verhältnis von 0,001:1 reicht aus, um das Wachstum von A. fulgidus zu hemmen. Die angezeigten Daten sind Vierfachexemplare mit Ausnahme des niedrigsten und des höchsten \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4} ^{2-}\)-Verhältnis, die dreifach durchgeführt wurden. Alle Experimente werden als Datenmittelwert und für b, c ± Standardabweichung (SD) dargestellt.

Quelldaten

a, Vergleich von ATPS in der Oberflächendarstellung, gefärbt durch die Domänenzusammensetzung I (gelb), II (hellgrün), III (Weizen) und APS-Kinase (dunkelorange). Die grauen Flächen entsprechen dem Gegenmonomer. ScATPS organisiert sich als Homohexamer. b: Monomere von MtATPS (gelb), TtATPS (grau), ScATPS (marineblau), RrsATPS (magenta), GmATPS (grün) und AaATPS (cyan) werden der Domäne II überlagert und als Cartoons dargestellt. Abkürzungen und RMSD finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. c, d, Oberfläche, die an der Oligomerisierung von MtATPS (c) und TtATPS (d) beteiligt ist. Ein Monomer wird in der Oberflächendarstellung und ein Monomer im Cartoon dargestellt. Die Monomer-Monomer-Kontakte, die durch die Domäne III einer Kette hergestellt werden (in Orange für MtATPS und schwarz für TtATPS), werden als rote Oberfläche dargestellt. Die weizenfarbene Oberfläche hebt Domäne III hervor. Der gerahmte Einlass ist eine Nahaufnahme des Zn-Bindungsmotivs und Reste, die das Zn koordinieren, sind als Stäbchen dargestellt. Kohlenstoff, Stickstoff und Schwefel sind orange/weiß, blau bzw. gelb gefärbt. e,f, Katalytische Stelle von MtATPS (apo, e) und TtATPS mit gebundenem APS (f). Die Elemente sind wie in den Einlässen (c, d) gefärbt, wobei Sauerstoff und Phosphor jeweils rot und orange sind. Reste, die zu den kanonischen Motiven des ATPS gehören, werden durch rosa gefärbte Kohlenstoffatome hervorgehoben.

a, Die heterodimere Sulfatadenylyltransferase (CysDN) mit der homooligomeren ATP-abhängigen Sulfurylase (sat) und b, APS-Kinasen. Für Panel a: Die heterodimere assimilatorische ATP-Sulfurylase besteht aus einer regulatorischen GTPase-Untereinheit CysN (hellrot) und einer katalytischen Untereinheit CysD (blau). Sat ist sowohl an der assimilatorischen als auch an der dissimilatorischen \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-Reduktion beteiligt (hellorange). MtATPS und MtAPSK sind fett rot hervorgehoben. Bootstrap-Unterstützungswerte ≥90 % werden als Punkte auf inneren Knoten angezeigt.

a, linkes Feld, homodimeres MtAPSK-Apo (orange), überlagert mit seinem nächsten Homologen Synechocystis sp. PCC 6803 (SsAPSK, weiß, PDB: 5CB6) im Komplex mit APS und AMP-PnP. Die Liganden sind in Stäbchen und Kugeln dargestellt und der fehlende Teil 125–152 in MtAPSK (gekennzeichnet durch Kugeln) ist in SsAPSK schwarz hervorgehoben. Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor sind jeweils in den Farben Hellorange/Weiß/Cyan, Blau, Rot, Gelb und Orange gefärbt. Rechtes Feld: Überlagerung von MtAPSK (Weizen), AtAPSK (orange, PDB: 3UIE), ApAPSK (Schiefer, PDB: 2YVU) und PcAPSK (weiß, PDB: 1M7H) auf einem Monomer und dargestellt im Cartoon. Die Position des aktiven Zentrums wird durch einen schwarzen Pfeil angezeigt. Abkürzungen und RMSD finden Sie in der Ergänzungstabelle 2. b, c, Katalytische Stelle von Apo MtAPSK (b) und SsAPSK gebunden an APS und AMP-PnP (c). Die Elemente sind wie in (a), linkes Feld, gefärbt. In (b) zeigen Pfeile den fehlenden Teil 125–152 an.

a, Faltungskonservierung über das MtPAPP, die NanoRNase A aus Bacillus subtilis (BsNrnA, PDB: 5IUF) und die Rekombinase RecJ aus Deinococcus radiodurans (DrRecJ, PDB: 5F55). Für BsNrnA und DrRecJ repräsentieren die Strukturen nur die DHH- und DHHA1-Domänen und die Sekundärstrukturmotive werden neu nummeriert, um den Vergleich mit MtPAPP zu vereinfachen. b, Unterschiede in der Nukleotidbindung zwischen MtPAPP, NanoRNase A und der Rekombinase RecJ, wobei die Oberflächenreste mit dem Liganden interagieren, grün gefärbt. c, Nahaufnahme der Mn2+-Koordination zwischen MtPAPP, BsNrnA (PDB: 5IZO) und DrRecJ (PDB: 5F55). Mn2+ wird als violette Kugeln dargestellt und die sie koordinierenden Reste werden als Stäbchen und Kugeln hervorgehoben. Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Phosphoratome sind jeweils in Grün/Grau, Blau, Rot und Orange gefärbt. Reste, die zum kanonischen DHH-Motiv gehören, haben rosa gefärbte Kohlenstoffatome. Die für BsNrnA verwendete Struktur ist die His103Ala-Variante, und die Seitenkette von His160 wurde nicht in der DrRecJ-Struktur modelliert.

a, PAP-Phosphatasen mit bifunktionellen Oligoribonukleasen und PAP-Phosphatasen sowie Exonukleasen (RecJ) und b, dissimilatorische APS-Reduktasen (α-Untereinheit) und (mutmaßliche) assimilatorische APS/PAPS-Reduktasen. MtPAPSR und MtPAPP sind fett rot hervorgehoben. Bootstrap-Unterstützungswerte ≥90 % werden als Punkte auf inneren Knoten angezeigt. Sternchen (*) vor Methanocaldococcus jannaschii-Sequenzen markieren die beiden zuvor biochemisch charakterisierten Enzyme.

a, Schema des gekoppelten Enzymassays zur Messung der MtPAPSR-Aktivität über die Oxidation von reduziertem Methylviologen (MVred) bei 600 nm unter einer N2-Atmosphäre und bei 45 °C. Die Enzyme wurden rekombinant in E. coli exprimiert, mit Ausnahme der Pyrophosphatase, die kommerziell erhältlich war. Der Reaktionsmix enthielt alle Enzyme, Metalle (Mn2+, Mg2+), HEPES-Puffer bei pH 7,0 und die Substrate \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) und ATP. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) gestartet. b, c, „Leer“ entspricht einer Lösung, die den Puffer, die Substrate, MVred und Dithionit, aber keine Enzyme enthält. „Alle Komponenten“ enthielten alle in Schema (a) gezeigten Verbindungen. b, Substratspezifität von MtPAPSR. „Kein MtAPSK“ entspricht allen Komponenten außer MtAPSK, das die Generierung von PAPS aus APS verhinderte. Mit APS als Substrat wurde eine spezifische enzymatische Aktivität von 0,007 ± 0,001 µmol oxidiertem MV.min−1.mg−1 von PAPSR gemessen, was nur 6,54 % der Aktivität mit dem APSK entspricht (entspricht Abb. 4a, +). APS-ATPS-APSK). Der Unterschied kann auf eine Instabilität des hinzugefügten APS zurückgeführt werden. c, Einfluss verschiedener Konzentrationen von MtPAPSR auf die Aktivität: Eine fünffache Zugabe von MtPAPSR führte zu einer Stimulierung der MV-Oxidationsrate um 220 % (dargestellt in dunkelgrünen Quadraten, „5 × mehr MtPAPSR“). Nach 30 Minuten führte die fünffache Zugabe der MtPAPS−Reduktase zur Aggregation, weshalb die OD600nm ab diesem Zeitpunkt zu steigen begann. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und als Datenmittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Quelldaten

Alle Strukturen sind im Cartoon mit ihren (Metallo-)Cofaktoren in Kugeln und Stäbchen dargestellt. Nahaufnahmen der aktiven Zentren (rechts) mit für die Substratbindung wichtigen Resten sind als Kugeln und Stäbchen hervorgehoben. Die dissimilatorische APS-Reduktase aus Archaeoglobus fulgidus ist ein Heterotetramer, bestehend aus zwei (αβ)-Untereinheiten. Jede β-Untereinheit enthält zwei [4Fe-4S]-Cluster und jede α-Untereinheit ein FAD. Das vorgestellte assimilatorische APSR aus Pseudomonas aeruginosa ist ein Homotetramer. Es enthält einen [4Fe-4S]-Cluster pro Monomer. Das assimilatorische PAPSR aus Saccharomyces cerevisiae ist homodimer. Die Elemente Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Eisen sind jeweils rot, blau, orange, gelb und braun gefärbt. Der Kohlenstoff des Substrats/Produkts ist in Cyan und beim FAD in Gelb gefärbt. Katalytische Rückstände werden durch rote Markierungen hervorgehoben.

Ergänzende Abbildungen. 1–8, Tabellen 1 und 2, Konstrukte und Gen-Codon-Optimierung und Diskussion.

Ergänzende Materialdatei.

Statistische Quelldaten für die ergänzende Abbildung 2.

Statistische Quelldaten.

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Unbearbeitete native Gele.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jespersen, M., Wagner, T. Assimilatorische Sulfatreduktion im marinen Methanogen Methanothermococcus thermolithotrophicus. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01398-8

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Eingegangen: 28. Februar 2023

Angenommen: 26. April 2023

Veröffentlicht: 05. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01398-8

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